Вальпроевая кислота (ВК), или 2-пропилвалериановая кислота, – одно из часто используемых противоэпилептических средств, терапевтический лекарственный мониторинг которого является важной задачей [1]. Сегодня это вещество входит в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов во многих странах, включая Российскую Федерацию1, и применяется не только в неврологии, но и в психиатрии [2][3].

В клинической практике используются различные соли и производные ВК: вальпроаты натрия, кальция, магния, а также дивалпроекс натрия (комплексное соединение ВК и вальпроата натрия в молярном соотношении 1:1) [4]. По данным на 2020 г., препараты ВК составили 36% всех потребляемых противоэпилептических средств в России [5].

ВК наиболее эффективна при генерализованных формах эпилепсии и является антиконвульсантом первого выбора [6]. В то же время препарат имеет большое число противопоказаний, в т.ч. обладает ярко выраженной тератогенной активностью [6], потенциальной гепатотоксичностью, нейротоксичностью [7]. Терапевтический диапазон ВК составляет 50–150 мкг/мл [8][9]. За счет высокой степени связывания ВК с белками ее концентрация в крови не всегда пропорциональна дозе препарата, фармакокинетические параметры могут сильно варьироваться не только от пациента к пациенту, но и у одного пациента в разные периоды приема [10][11]. Исходя из всех условий, прием ВК обязан сочетаться с регулярным терапевтическим лекарственным мониторингом.

Основные методы анализа для определения концентрации ВК в крови – иммунологические и хроматографические [12]. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС / ВЭЖХ-МС/МС) является «золотым стандартом» при количественном определении содержания низкомолекулярных эндогенных метаболитов и терапевтическом лекарственном мониторинге, в т.ч. и ВК [13][14], поскольку обладает высокими универсальностью, чувствительностью и селективностью [12]. Однако для анализа ВК этот метод применяется относительно редко ввиду высокой стоимости оборудования. Метод газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) также показывает высокую селективность и чувствительность при определении ВК, однако чаще всего перед проведением анализа требуется стадия дериватизации, что увеличивает время подготовки образцов [15][16]. К достоинствам иммунологических методов можно отнести высокую скорость проведения процедуры, что хорошо подходит для рутинного анализа, однако перекрестная реактивность антител к метаболитам ВК может приводить к завышению полученных результатов [12][17].

Цель – разработка и валидация методики количественного определения ВК в сыворотке крови методом ГХ-МС без дериватизации с добавлением фенилуксусной кислоты в качестве внутреннего стандарта (ВС) для терапевтического лекарственного мониторинга, проведение сравнительного анализа результатов, полученных с помощью разработанного и иммунохимического методов.

В работе использовали следующие реактивы и органические растворители: аналитический стандарт вальпроата натрия, аналитический стандарт фенилуксусной кислоты (оба – Sigma-Aldrich, США), соляная кислота (особо чистая), вода деионизированная с сопротивлением 18 МОм, этилацетат (особо чистый), ацетонитрил HPLC-S Gradient (Biosolve Chimie, Франция), метанол для градиентной ВЭЖХ (ООО «Акваметрия», Россия). В качестве газа-носителя применяли гелий высокой чистоты (марка 6.0).

Калибровочные образцы (5, 15, 30, 50, 75, 100, 150, 200 мкг/мл в пересчете на ВК) и образцы контроля качества (5, 15, 100, 150 мкг/мл в пересчете на ВК) готовили путем добавления известного количества стандарта вальпроата натрия в интактную сыворотку крови. Для количественного определения использовали метод внутреннего стандарта. В качестве ВС применяли раствор фенилуксусной кислоты в ацетонитриле с конечной концентрацией 1100 мкг/мл. Калибровочная кривая представляла собой зависимость концентрации ВК от отношения площади пика ВК к площади пика ВС (линейная функция с нормированием 1/X).

В работе применяли систему ГХ-МС, состоящую из моноквадрупольного МС-детектора Agilent 5977B SQ, оснащенного высокоэффективным источником ионизации электронным ударом, и газового хроматографа Agilent 7890 (оба – Agilent Technologies, США). Количественное определение исследуемых веществ проводили при ионизации электронным ударом с использованием режима сканирования «мониторинг выбранных ионов». Для ВК применяли характеристичный фрагментный ион с отношением массы к заряду (m/z) 102, для ВС – характеристичный фрагментный ион наибольшей интенсивности с m/z 91.

Хроматографическое разделение осуществляли на колонке HP-5MS Ultra Inert 30 м × 250 мкм × 0,25 мкм (Agilent Technologies, США). Температура канала ввода составляла 250 °С. Температура термостата в процессе анализа менялась градиентно: с 0-й до 2-й минуты с момента ввода пробы – 70 °С, со 2-й до 5-й минуты повышалась до 150 °С, затем с 5-й до 7-й минуты – до 250 °С, какой и оставалась до окончания анализа. Общее время анализа составило 9 мин. Скорость потока газа-носителя через колонку – 1 мл/мин. Ввод пробы осуществляли в режиме деления потока 50:1 (объем ввода – 1 мкл). В этих условиях время удерживания ВК составило 4,916 мин, ВС – 5,721 мин.

Валидацию методики количественного определения ВК в сыворотке крови методом ГХ-МС проводили в соответствии с отечественными и международными рекомендациями по валидации биоаналитических методов2 [18][19].

Валидация методики включала следующие параметры: селективность, воспроизводимость, правильность и прецизионность, эффект матрицы, степень извлечения, стабильность, линейность разбавления, эффект переноса. Нижний предел количественного определения (НПКО) составил 5 мкг/мл, диапазон концентраций – от 5 до 200 мкг/мл. Терапевтический диапазон ВК считали равным 50–150 мкг/мл [8][9], поэтому аналитический диапазон разработанной методики позволяет использовать ее для терапевтического лекарственного мониторинга.

Для оценки воспроизводимости результатов получили калибровочные зависимости и провели обратный расчет концентраций. Калибровочные зависимости представляли собой линейные функции с нормированием 1/X и описывались уравнением типа:

Y = K × X + B (с коэффициентом корреляции R²≥0,99),

где Y – отношение площади пика ВК к площади пика ВС; X – концентрация ВК; K – наклон; B – отсекаемый участок.

Для оценки стабильности ВК в сыворотке крови использовали образцы контроля качества 15 и 150 мкг/мл. Анализ образцов стабильности проводили вместе со свежеприготовленными образцами в составе одной аналитической серии. Рассчитанные концентрации образцов после хранения сравнивали со средними значениями концентраций свежеприготовленных образцов контроля качества путем расчета нормализованного модуля разницы (НМР) значений концентраций до и после хранения по формуле:

НМР, % = (C2 – C1) / C1 × 100,

где C2 – средняя концентрация образца после хранения; С1 – средняя концентрация свежеприготовленного образца.

Иммунохимический анализ содержания ВК в сыворотке крови выполняли на автоматическом анализаторе Architect i2000SR (Abbott, США). Метод основан на конкурентном иммунохемилюминесцентном анализе (ИХЛА), принцип которого заключается в комплементарном соединении субстрата и антитела, вступающих в реакцию, которая сопровождается хемилюминесценцией. Для постановки анализа использовали реагенты Architect iValproic Acid Reagent Kit. Аналитический диапазон определения содержания ВК данным методом составляет 2–150 мкг/мл [20].

В качестве программного обеспечения применяли MassHunter WorkStantion Software (Agilent Technologies, США). Сравнительный анализ результатов, полученных при определении содержания ВК в 46 образцах сыворотки крови с помощью ГХ-МС и ИХЛА проводили с помощью языка программирования R в интерфейсе RStudio (версия 4.5.0).

Нормальность распределения данных проверяли при помощи теста Шапиро–Уилка, равенство выборок – с помощью критерия Уилкоксона (уровень значимости α=0,05). Для проверки смещения результатов в зависимости от выбранного метода анализа и визуализации результатов сравнения построили диаграмму Бланда–Альтмана.

Для проверки сходимости результатов между двумя методами использовали регрессию Пэссинга–Бэблока. Уравнение линейной регрессии:

Y = K × X + B,

где X – результаты, получаемые при анализе методом ИХЛА; Y – результаты, получаемые по разработанной нами методике ГХ-МС; К – угловой коэффициент; В – константа.

На сегодняшний день в научной литературе есть несколько публикаций, где описано применение метода ГХ-МС для определения ВК, извлекаемой из биологической матрицы жидкостно-жидкостной экстракцией [16][21][22]. Основные параметры представлены в таблице 1.

Разработанная нами методика определения концентрации ВК в сыворотке крови методом ГХ-МС обладает рядом преимуществ в сравнении с литературными данными:

– использование для анализа всего 50 мкл сыворотки крови;

– применение фенилуксусной кислоты в качестве ВС;

– использование для подкисления всего 10 мкл 1М раствора соляной кислоты;

– отсутствие стадий упаривания органического слоя и дериватизации экстрагированной ВК.

Несмотря на более высокий нижний предел количественного определения (5 мкг/мл) в сравнении с литературными данными [16][22], разработанная методика обеспечивает необходимую точность и надежность измерений, т.к. терапевтический диапазон определения ВК составляет 50–150 мкг/мл.

Разработка

Использование ВС при проведении анализа необходимо для минимизации погрешностей, связанных с пробоподготовкой, инжекцией и детектированием. Зачастую применяют меченые ВС, однако высокая стоимость ограничивает их доступность для многих лабораторий. В качестве доступной и эффективной альтернативы выбрали фенилуксусную кислоту. Выбор обусловлен структурным сходством с ВК, термостабильностью и летучестью, что делает ее потенциально пригодной для использования в качестве ВС.

Детектирование ВК и ВС при количественном определении выполняли при ионизации электронным ударом с использованием режима сканирования «мониторинг выбранных ионов». На основании литературных данных для ВК были выбраны фрагментные ионы с m/z 73, 102, 115 [16], а для фенилуксусной кислоты – с m/z 91, 923. При количественном определении для ВК применяли характеристичный фрагментный ион с m/z 102, для ВС – характеристичный фрагментный ион наибольшей интенсивности с m/z 91.

Наиболее значимым этапом при разработке методики количественного определения ВК в сыворотке крови являлась экстракция определяемых компонентов из матрицы. Наиболее распространенные подходы – твердофазная экстракция (ТФЭ) и жидкостно-жидкостная экстракция (ЖЖЭ) [15]. Несмотря на более высокую эффективность очистки, ТФЭ характеризуется сравнительно высокой стоимостью и большей трудоемкостью по сравнению с ЖЖЭ. Поэтому в качестве методики пробоподготовки выбрали ЖЖЭ с предварительным подкислением сыворотки крови соляной кислотой и провели оптимизацию условий экстракции ВК и ВС.

Исходный протокол пробоподготовки заключался в добавлении к 100 мкл сыворотки крови 10 мкл раствора ВС (раствор фенилуксусной кислоты в ацетонитриле с концентрацией 1100 мкг/мл), водного раствора соляной кислоты и 1000 мкл этилацетата. Полученную смесь тщательно встряхивали с помощью термошейкера TS-100 (BioSan, Латвия) в течение 5 мин, затем центрифугировали при скорости вращения 14 000 об/мин в течение 3 мин при 5 °С, после чего 400 мкл супернатанта переносили в виалы и использовали для анализа. В качестве оптимизируемых параметров варьировали концентрацию (0,1; 0,2; 0,5; 1; 2 М) и добавляемый объем (10, 20, 30, 50 мкл) соляной кислоты.

Оптимизация

Анализ результатов оптимизации показал, что при использовании низкой концентрации соляной кислоты (0,1; 0,2 М) не удалось достичь эффективной экстракции для ВК (добавляемый объем – 10, 20 мкл) и ВС (добавляемый объем – 10, 20, 30 мкл). При использовании соляной кислоты с концентрацией 0,5 М и больше удалось достичь высокой степени извлечения (добавляемый объем – 20, 30, 50 мкл) для определяемых соединений. Оптимальными условиями для ВК и ВС были выбраны: концентрация соляной кислоты 1 М, добавляемый объем 20 мкл. Результаты оптимизации в виде зависимостей площади пика анализируемого соединения от концентрации соляной кислоты для каждого добавляемого объема приведены на рисунке 1.

С целью уменьшения объема сыворотки (что особенно актуально для детей, у которых взятие биоматериала может вызывать трудности) сократили количество всех компонентов в два раза, при этом эффективность экстракции не изменилась.

Таким образом, за рабочую методику пробоподготовки приняли: к 50 мкл сыворотки крови добавляли 5 мкл раствора ВС, 10 мкл 1 М раствора соляной кислоты и 500 мкл этилацетата. Полученную смесь тщательно встряхивали с помощью термошейкера TS-100 в течение 5 мин, затем центрифугировали при скорости вращения 14 000 об/мин в течение 3 мин при 5 °С, после чего 400 мкл супернатанта переносили в виалы и использовали для анализа.

Валидация

Селективность

Для определения селективности тестировали шесть образцов биологической матрицы, обработанной без прибавления стандарта ВК и ВС, на возможность создания помех потенциально мешающими веществами (эндогенные компоненты матрицы, метаболиты, продукты разложения). Полученные значения площадей сравнивали со значениями в образцах контроля качества с концентрацией ВК, равной НПКО.

Селективность определения ВК установлена, т.к. отсутствуют мешающие пики на временах удерживания определяемых соединений. Примеры хроматограмм интактной сыворотки крови, не содержащей определяемых соединений, приведены на рисунке 2.

Воспроизводимость

Калибровочная зависимость состояла из восьми ненулевых калибровочных образцов, охватывающих диапазон концентраций 5–200 мкг/мл для ВК. НПКО с концентрацией ВК 5 мкг/мл приняли в качестве предела количественного определения, т.к. показания образца на нижнем количественном пределе были как минимум в 5 раз больше показаний пустой пробы (соотношение «сигнал/шум» больше 5), поддавались определению и были воспроизводимы с прецизионностью 0,9%, не превышающей 20%, и правильностью 102,4%, входящей в диапазон 80–120%. Примеры хроматограмм сыворотки крови 5 мкг/мл ВК и 1100 мкг/мл ВС представлены на рисунке 3.

Для оценки воспроизводимости результатов получили три калибровочные зависимости и провели обратный расчет концентраций. Пример калибровочной зависимости приведен на рисунке 4. Воспроизводимость результатов достигается во всем интервале концентраций (табл. 2).

Правильность и прецизионность

Правильность и прецизионность метода внутри одной серии и между аналитическими сериями оценивали по результатам параллельных анализов образцов контроля качества с концентрациями ВК 5, 15, 100, 150 мкг/мл соответственно. Каждый образец внутри серии определяли в пяти повторах. Расчет концентраций образцов контроля качества проводили по калибровочной зависимости, полученной в составе той же аналитической серии.

Данные по правильности (отклонение рассчитанных значений нижнего образца контроля качества от номинального значения не должно превышать 20%, остальных образцов контроля качества – 15%) и прецизионности (коэффициент вариации нижнего образца контроля качества не должен превышать 20%, остальных образцов контроля качества – 15%) определения ВК в сыворотке крови между аналитическими сериями представлены в таблице 3 и соответствуют критериям приемлемости.

Эффект матрицы

Влияние матрицы на сигнал ВК определяли путем вычисления фактора матрицы (ФМ) – отношения площади пика в присутствии матрицы к площади пика в отсутствие матрицы (чистый раствор определяемых соединений) для каждой серии матрицы для ВК и ВС. При данном тесте исследованы шесть образцов матрицы (сыворотка крови различных типов, включая гемолизированную и гиперлипидемическую, а также плазма крови). Путем деления ФМ ВК на ФМ ВС рассчитывали нормализованный по ВС ФМ. Измерения осуществляли для образцов контроля качества 15 и 150 мкг/мл. Нормализованные по ВС ФМ составили 0,96 с коэффициентом вариации 4,1% и 1,03 с коэффициентом вариации 3,9% для образцов контролей качества 15 и 150 мкг/мл соответственно, что говорит об отсутствии влияния матрицы на сигнал ВК.

Степень извлечения

Степень извлечения ВК и ВС из сыворотки крови определяли путем сравнения площадей пиков аналита и ВС в образцах контроля качества 15 и 150 мкг/мл с площадями пиков неэкстрагированных стандартных растворов, представляющих 100% извлечение и содержащих компоненты матрицы. Измерения для каждой концентрации образцов проводили в шести повторах. Степени извлечения ВК и ВС составили 100,8% и 99,4% соответственно.

Стабильность

ВК стабильна: после трех циклов «заморозка – разморозка» (заморозка при –20 °С, разморозка при комнатной температуре), до пробоподготовки в течение 28 ч при комнатной температуре, после пробоподготовки в течение 36 ч при комнатной температуре, в условиях длительной заморозки при температуре –20 °С в течение 35 сут. Значения НМР, коэффициента вариации и отклонений рассчитанных значений концентраций не превышали 15%.

Линейность разбавления

Доказана линейность двукратного разбавления модельного образца с концентрацией 300 мкг/мл, превышающей концентрацию верхнего предела количественного определения. После разбавления образца интактной сывороткой крови в 2 раза проводили пробоподготовку и анализ образцов. Концентрацию аналита определяли в пяти повторах. Теоретическое значение концентрации разбавленного образца составило 150 мкг/мл. Значения коэффициента вариации и отклонений рассчитанных значений концентраций не превышали 15%.

Эффект переноса

Эффект переноса изучали путем введения образцов интактной сыворотки крови после образцов контроля качества 150 мкг/мл. Для сравнения использовали значения площадей пиков ВК в образцах контроля качества 5 мкг/мл. Перенос в образец интактной сыворотки крови после образца с высокой концентрацией не превышает 20% величины НПКО и 5% ВС.

Сравнительный анализ результатов, полученных при определении содержания ВК с помощью ГХ-МС и ИХЛА проводили на 46 образцах сыворотки крови.

Значение p по тесту Шапиро-Уилка составило 0,025, из чего следует, что распределение не является нормальным [23][24]. Согласно критерию Уилкоксона значение p составило 0,596, из чего следует, что выборки равны между собой, существенных статистических различий нет [23].

Для проверки смещения результатов в зависимости от выбранного метода анализа построили диаграмму Бланда–Альтмана [24][25]. На рисунке 5 видно, что систематическое смещение результатов отсутствует и при попарном сравнении результатов разница между ними находится в диапазоне от –10% до +10%.

Для проверки сходимости результатов между двумя методами построили регрессию Пэссинга–Бэблока (рис. 6) [25]. Показано, что при низких концентрациях наблюдается минимальное различие между измеренными значениями, однако уже при концентрации 60 мкг/мл прямая линейной регрессии полностью сливается с диагональю совпадений (уравнение линейной регрессии Y = 1,02X – 1,91). Небольшое завышение результатов, полученных методом ИХЛА, может быть связано с кросс-реактивностью антител к метаболитам ВК. Однако статистическое различие между методами пренебрежимо мало, т.к. систематическое смещение результатов не превышает 2%.

Результаты расчетов приведены в таблице 4. Границы доверительного интервала для Slope включают 1, а для Intersept – 0, что указывает на отсутствие значимых различий между методами.

Проведенное исследование показало, что разработанная и валидированная методика ГХ-МС позволяет использовать для анализа всего 50 мкл сыворотки крови, что особенно актуально для детей, у которых взятие биоматериала может вызывать трудности. Сравнительный анализ содержания ВК между ГХ-МС и ИХЛА продемонстрировал высокую степень корреляции, что подтверждает надежность разработанного метода. Аналитический диапазон методики ГХ-МС (5–200 мкг/мл) позволяет использовать ее в клинической практике и успешно интегрировать в систему терапевтического лекарственного мониторинга для оптимизации дозирования препаратов ВК у пациентов, что способствует повышению безопасности и эффективности терапии.

1. Распоряжение Правительства Российской Федерации от 18 декабря 2025 г. №3867-р «Об утверждении перечня жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов для медицинского применения, перечня лекарственных препаратов, предназначенных для обеспечения лиц, больных гемофилией, муковисцидозом, гипофизарным нанизмом, болезнью Гоше, а также минимального ассортимента лекарственных препаратов, необходимых для оказания медицинской помощи» (https://base.garant.ru/413344482). 2. Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 г. № 85 «Об утверждении Правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза» (https://base.garant.ru/71546368). 3. Human Metabolome Database (https://hmdb.ca/metabolites/HMDB0000209).