Юношеская миоклоническая эпилепсия (ЮМЭ) является наиболее распространенной формой эпилепсии, на ее долю приходится около 9,3% всех эпилепсий [1]. ЮМЭ характеризуется наличием абсансов, миоклонических приступов и генерализованных тонико-клонических приступов (ГТКП), обычно возникающих после пробуждения. Члены семьи пациента с ЮМЭ часто также страдают эпилепсией с вариабельным фенотипом [2].

Согласно классификации эпилепсии Международной Противоэпилептической Лиги (англ. International League Against Epilepsy, ILAE) 2017 г. ЮМЭ относится к генетическим генерализованным эпилепсиям (ГГЭ) [3]. Однако в 2021 г. рабочая группа по нозологии и определениям ILAE в драфт-версии публикации выделила четыре формы ГГЭ в отдельную группу идиопатической генерализованной эпилепсии (ИГЭ) [4].

ИГЭ – группа зависящих от возраста расстройств с характерными отличительными электро-клиническими особенностями и известной или предполагаемой генетической этиологией [4]. ИГЭ характеризуются наличием абсансов, миоклонических приступов и ГТКП [5] с дебютом в детском или юношеском возрасте и являются одной из наиболее распространенных форм эпилепсии, составляя до 1/3 от всех форм заболевания [6]. К ИГЭ относят следующие формы: детская абсансная эпилепсия (ДАЭ), ЮМЭ, юношеская абсансная эпилепсия (ЮАЭ) и эпилепсия с ГТКП [7].

Клинические близнецовые и семейные исследования показывают, что ИГЭ могут быть генетически обусловлены [2][8]. Монозиготные близнецы высококонкордантны, со 100% конкордантностью по электроэнцефалографическому признаку: генерализованная спайкволновая активность, 70% совпадений эпилептических приступов [9][10]. Долгое время ученые считали, что в основе ИГЭ лежат сложные механизмы наследования, подразумевая возможную полигенную природу с наличием либо отсутствием влияния факторов окружающей среды [4].

Однако, несмотря на клиническое подтверждение наследственного характера ИГЭ, патогенные варианты, ассоциированные с развитием данных форм заболевания, до сих пор недостаточно изучены [4].

В небольшой части случаев выявлены моногенные причины ИГЭ, включающие гены, кодирующие субъединицы рецептора гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) (например, GABRG2, GABRA1) [11][12], и ген, кодирующий транспортер глюкозы 1 (SLC2A1) [13]. Описаны как унаследованные от родителей, так и de novo мутации. В случае наследуемых мутаций возможна неполная пенетрантность патогенного варианта. У большого числа больных ИГЭ родословная не отягощена по эпилепсии, что объясняется либо мутацией de novo, либо сложным наследованием [14].

Кроме моногенных вариантов у 3% пациентов с ИГЭ встречаются варианты числа копий: микроделеции и микродупликации [15][16]. В настоящее время считается, что они вносят свой вклад в этиологию, но не являются причиной заболевания. Данные генетические варианты могут быть семейными или возникать de novo и существенно увеличивать риск ИГЭ [17].

Клинические близнецовые исследования показали генетический вклад в патогенез ЮМЭ [4]. В ряде исследований сообщалось о носительстве патогенных вариантов у больных ЮМЭ в генах CACNB4, GABRA1, GABRD и EFHC1 [18–20].

Однако генетическое тестирование не является частью текущей рутинной диагностической практики как при ЮМЭ, так и при других формах ИГЭ. Поиск этиологических причин развития ЮМЭ продолжается в настоящее время.

Цель – анализ результатов полноэкзомного секвенирования у пациентов с ЮМЭ и поиск ассоциативных связей с заболеванием.

Для генетического исследования на базе Неврологического центра Университетской клиники ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России были последовательно набраны 7 пациентов с подтвержденным диагнозом ЮМЭ согласно критериям ILAE и 1 ребенок пробанда без клинических признаков заболевания на момент проведения исследования (табл. 1).

Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики и принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации 2013 г., одобрено локальным этическим комитетом. Все участники подписали информированное согласие.

Геномная ДНК была выделена из периферической крови пациентов с использованием коммерческого набора QIAmp DNA MiniKiT (Helicon, Россия) по стандартному для него протоколу на оборудовании центра коллективного пользования «Молекулярные и клеточные технологии» ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России. Экзом пациентов получен обогащением образцов ДНК с помощью коммерческого набора Clinical exome solution v2 (Sophia Genetics, Швейцария) по стандартному протоколу. Обогащенные библиотеки далее секвенировались с использованием платформы MiSeq Illumina: MiSeq Reagent Kit v3 (2×300bp) (Illumina, США) в лаборатории лесной геномики Института фундаментальной биологии и биотехнологии ФГАОУ ВО «Сибирский федеральный университет». Длина полученных парных прочтений составляла не менее 250 пар оснований.

Парные прочтения, полученные после секвенирования, были предоставлены в формате FASTq. Для их анализа применяли специализированную платформу Genomenal: NGS Wizard (Novel Software Systems, Россия). Фильтрацию проводили с использованием двух панелей генов:

1) панель «Наследственные эпилепсии», включающая наиболее полный список ассоциированных с эпилепсией генов (всего 977), разделенных на четыре категории в зависимости от проявления заболевания в фенотипе:

84 гена, ассоциированные только с эпилепсией или синдромами эпилепсии в качестве основного симптома,

73 гена, ассоциированные с врожденными пороками развития головного мозга и эпилепсией,

536 генов, связанных с грубыми нарушениями физического развития или другими системными отклонениями, сопровождающимися эпилептическими приступами,

284 гена-кандидата, требующие дальнейшей проверки [21];

2) панель «ЮМЭ», включающая гены, ассоциированные с развитием ЮМЭ: BRD2, CACNB4, CHRNA4, CLCN2, CX36, EFHC1, GABRA1, GABRD, JRK, ME2 GRM4, CHRM3 [18].

Обнаруженные варианты фильтровались с помощью сервиса для автоматической обработки геномных данных NGS Wizard на платформе Genomenal (Novel Software Systems, Россия), обращающейся к базам данных ClinVar [22], nomAD [23], ExAC [24], OMIM [25], Ensembl [26], NCBI [27], UniProt [28]. Варианты были отсортированы по значению эффекта. Варианты со значением High принимались за патогенные. Это значение получали варианты, приводящие к таким генетическим перестройкам, как frameshift, start lost, splice donor, splice acceptor и stop gained. Найденные варианты были классифицированы с использованием рекомендаций для интерпретации данных, полученных методами массового параллельного секвенирования [29].

При анализе данных, полученных с использованием общей панели генов эпилепсии, было идентифицировано 59 вариантов, среди них 42 с невыясненной патогенностью, 2 вероятно патогенных и 8 патогенных (табл. 2).

Выявлено гетерозиготное носительство патогенных вариантов в генах рецессивных заболеваний: SACS, AHI1, CEP164, ANO10, RMND1, POMGNT1, FLG, ACTB (см. табл. 1). Изменения в данных генах могут быть ассоциированы с патологическими фенотипами, для которых наличие эпилептического приступа не является обязательным симптомом. При анализе найденных генетических вариантов у обследованных нами пациентов ассоциации с клинической картиной заболевания не выявлено.

Данные, полученные с использованием панели генов, ассоциированных с развитием ЮМЭ, представлены в таблице 3.

У обследованных нами пациентов выявлены миссенсмутации в генах CLCN2, EFHC1, JRK, ME2 и frameshiftмутация в гене CACNB4 (см. табл. 2). Патогенных вариантов в исследуемых генах, ассоциированных с развитием ЮМЭ, в ходе анализа обнаружено не было.

Большинство патогенных вариантов, ассоциированных с эпилепсией, располагаются в генах, кодирующих субъединицы нейрональных ионных каналов [30], что приводит к гипервозбудимости или недостаточности механизмов торможения нейронов головного мозга.

Ген GABRG2 кодирует гамма-субъединицу ГАМКрецепторов. В ряде публикаций сообщалось о следующих однонуклеотидных вариантах (ОНВ) гена GABRG2, ассоциированных с развитием различных форм ГГЭ: N79S (генетическая эпилепсия (ГЭ) с фебрильными приступами плюс), R82Q (ГЭ с фебрильными приступами плюс), P83S (ГЭ с фебрильными приступами плюс), R177G (GEFS+, ДАЭ), K328M (ГЭ с фебрильными приступами плюс) [31–34]. Эти варианты представляют собой миссенс-мутации, каждая из которых приводила к снижению поверхностной экспрессии субъединицы гамма-2 в комплексе ГАМК-рецептора типа А либо к изменению кинетических свойств канала. Кроме того, описаны нонсенс-мутации в гене GABRG2: Q40X (синдром Драве) [33][35][36], R136X (ГЭ с фебрильными приступами плюс) [37], Q390X (ГЭ с фебрильными приступами плюс, синдром Драве) [38], W429Х (ГЭ с фебрильными приступами плюс) [39]. Они приводят к снижению или полному отсутствию поверхностной экспрессии субъединицы гамма-2.

Помимо носительства ОНВ в некоторых исследованиях была обнаружена делеция c.1329delC гена GABRG2 (ГЭ с фебрильными приступами плюс) [40], появление которой вызывает экспрессию модифицированной субъединицы гамма-2 с удлиненным С-концевым доменом, образовавшимся в результате сдвига рамки считывания, последующего удаления естественного стоп-кодона и дальнейшей элонгации полипептидной цепочки путем транскрибирования некодирующей области. В результате происходит снижение гидрофобных свойств С-концевого домена субъединицы гамма-2.

Также описана мутация в сайте сплайсинга VS6+2T>G [41], приводящая к выпадению экзона 6 гена GABRG2 и преждевременному образованию стоп-кодона у пациентов с ДАЭ. ОНВ rs211037 (Asn196Asn) гена GABRG2 выявлен у пациентов с эпилепсией независимо от ее фенотипа – как с ЮМЭ, так и с мезиальной височной эпилепсией. Вариант rs211037 играет важную роль в регуляции транскрипции и регуляции сплайсинга данного гена [42].

Ген GABRA1 кодирует субъединицу альфа-1 ГАМКрецептора типа А. Среди миссенс-мутаций в данном гене обнаружены следующие патогенные варианты: exon9322 C>A, приводящий к замене аланина на аспарагин в позиции 322 у пациентов с диагностированной ЮМЭ [12], и 975delC, приводящий к преждевременной терминации трансляции в экзоне 8 гена GABRA1. Данный патогенный вариант ассоциирован с развитием ДАЭ [43][44]. Транслированный измененный белок имел пониженную стабильность из-за деградации, связанной с эндоплазматическим ретикулумом [43, 44]. ОНВ 659G>A гена GABRA1 снижает поверхностную экспрессию зрелого белка и/или эффективность нейротрансмиттера у пациентов с ЮМЭ и ДАЭ [45].

Инсерция K353delins18X гена GABRA1, представляющая собой вставку длиной 25 пар оснований, связана с сохранением интронной области в транскрипте, что также приводит к снижению поверхностной экспрессии ионного канала у пациентов с ЮМЭ и ДАЭ [45].

Ген EFHC1, расположенный на коротком плече 6-й хромосомы, кодирует белок, состоящий из 640 аминокислотных остатков и обладающий апоптозной активностью, с EF-hand мотивом, представляющим собой мотив связывания ионов кальция и не являющийся субъединицей ионного канала. У пациентов с ЮМЭ были обнаружены следующие миссенс-мутации в данном гене: 685T>C, 628G>A, 757G>T, 545G>A, 229C>A, 662G>A [46]. Эффект этих патогенных вариантов был изучен путем трансфекции клеточной культуры гиппокампа мыши вектором, содержащим дикий и мутантные варианты гена. В группе, трансфицированной мутантным вариантом, наблюдалось снижение клеточной смерти по сравнению с контрольной группой [46].

В семейных случаях ЮМЭ были выявлены ОНВ гена EFHC1: 685T>C, 1057C>T [47], 755C>A, 1523C>G; делеции: 789del.A, 362del.GAT; нонсенс-мутация: 829C>T [48]. Также в исследовании R. Thounaojam et al. (2017 г.) у пациентов с ЮМЭ обнаружены новые ОНВ 661C>T, 779G>A и 730C>T, приводящие к аминокислотным заменам и формированию преждевременного стоп-кодона: R221C, R260Q и R244STOP соответственно [49].

С другой стороны, D. Pinto et al. (2006 г.) сообщили об отсутствии патогенных ОНВ у 112 голландских пациентов с диагностированной ЮМЭ [50], что может свидетельствовать об отсутствии однозначной ассоциации гена EFHC1 с развитием ЮМЭ.

Ген CACNB4 кодирует субъединицу бета-4 потенциалзависимого кальциевого канала, играющего важнейшую роль в высвобождении нейротрансмиттеров в нейронах головного мозга. Субъединицы бета участвуют в трансмембранном переносе субъединиц альфа при сборке ионного канала. Ген CACNB4 располагается во 2-й хромосоме в локусе 2q22-23. Обнаружена нонсенс-мутация 1444C>T в гене CACNB4, приводящая к формированию преждевременного стоп-кодона R482X и элиминации 38 аминокислот С-концевого домена в семьях с ЮМЭ в качестве основного патологического фенотипа. В том же исследовании выявлена мутация 311G>T в гене CACNB4, приводящая к замене цистеина на фенилаланин C104F. Оба варианта вызывают увеличение скорости инактивации ионного канала [51].

CLCN2 – ген, кодирующий потенциал-зависимый хлоридный канал, располагается в локусе 3q26. Он сильно экспрессируется в головном мозге, особенно в нейронах, ингибируемых ГАМК. Предполагается, что CLCN2 играет важную роль в поддержании низкой внутриклеточной концентрации ионов хлора (Cl–), необходимой для ингибирующего ответа ГАМК. Мутации в данном локусе были найдены у пациентов с ЮМЭ, ДАЭ, ИГЭ с тонико-клоническими приступами пробуждения [52]. К. Haug et al. (2003 г.) обнаружили три типа гетерозиготных мутаций, приводящих к преждевременному формированию стопкодона, атипичному сплайсингу и небольшой аминокислотной замене [53]. Так, носительство варианта 597insG приводит к сдвигу рамки считывания и преждевременному формированию стоп-кодона в положении 231 [54]. Вариант IVS2-14del11 (делеция 11 пар оснований в интроне 2 рядом с сайтом сплайсинга) вызывает образование альтернативного продукта сплайсинга с утратой 44 аминокислотных остатков в экзоне 3. Миссенс-мутация 2144G>A обусловливает неконсервативную аминокислотную замену в С-концевом участке белка [54]. А миссенс-мутация 2154G>C в гене CLCN2 приводит к замене глутамина на аспарагин в позиции 718 [55].

Тем не менее, вопрос об ассоциации гена CLCN2 с ИГЭ, в т.ч. ЮМЭ, остается дискуссионным. Негативный эффект вышеописанных мутаций не воспроизвелся в исследовании M.I. Niemeyer (2009 г.) [56]. Кроме того, потенциально патогенные варианты гена CLCN2 были найдены и среди членов контрольных групп, поэтому мутации в CLCN2 могут быть лишь редкой причиной ИГЭ [57]. В исследовании H. Xie et al. (2019 г.) обнаружена новая миссенс-мутация 481G>A у пациента с ДАЭ, приводящая к замене глицина на серин и потенциально вызывающая изменение мотива селективного фильтра хлоридного ионного канала [58]. По-видимому, патогенные варианты гена CLCN2 являются минорными, их роль в патогенезе ИГЭ на сегодняшний день неясна.

Однако при популяционной стратификации ассоциированных с ЮМЭ вариантов, выявленных в исследованиях «случай–контроль», результаты не воспроизводились [19].

Ген BRD2 кодирует бромодоменсодержащий белок 2, локализованный на хромосоме 6p21.3. Нокаут данного гена у мышей приводит к нарушениям в формировании невральной трубки и головного мозга в эмбиогенезе, а гетерозиготное носительство мутаций в гене повышает риск эпилептогенеза [59]. Исследование ОНВ rs206787 и rs516535 гена BRD2 не выявило статистически значимых различий между больными ЮМЭ и контрольной группой [60][61].

Также в настоящее время возможными кандидатами, ассоциированными с ИГЭ, считаются ОНВ гена GABRB3: 1437T>G, 897T>C, 541T>C, 66 G>C, 75 G>A (ДАЭ) [62]; гена SLC12A5: L246P, G551D (ИГЭ с тонико-клоническими приступами пробуждения) [63]; гена SLC2A1: 696G>A, 641T>C (ДАЭ) [64].

К настоящему времени большинство изученных вариантов предрасположенности к ЮМЭ имеют недостаточную доказательную базу. Только rs2029461 гена GRM4, rs3743123 гена CX36 и rs3918149 гена BRD2 были связаны с ЮМЭ, по крайней мере, в двух независимых исследованиях генов-кандидатов [18]. А rs12059546 гена CHRM3 показал полногеномное значение для ЮМЭ. Однако эта положительная ассоциация не была воспроизведена в исследовании «случай–контроль», проведенном среди населения Китая [65].

В нашем исследовании не было идентифицировано ни одного патогенного или потенциально патогенного варианта в вышеуказанных генах.

Авторы выражают признательность компании Novel Software Systems (Россия) за оказанную помощь в анализе и интерпретации данных, полученных в ходе исследования.

В последние годы значительные усилия направлены на идентификацию генов предрасположенности к ЮМЭ. В ходе проведенного нами исследования моногенных и/или полигенных патогенных вариантов у обследованных пациентов с ЮМЭ и ребенка пробанда с ЮМЭ не выявлено. Высокая генетическая гетерогенность ЮМЭ может объяснить многочисленные безуспешные попытки найти гены предрасположенности к ЮМЭ. Необходимы дальнейшие исследования для подтверждения вариантов, ассоциированных с развитием ЮМЭ. Достижения в области геномных технологий могут расширить наше понимание генетики ЮМЭ.