Клинико-нейроиммунологические корреляции при постинсультной эпилепсии на примере нейронспецифической енолазы и фактора роста эндотелия сосудов

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

Цереброваскулярные заболевания могут приводить к развитию эпилепсии у пожилых людей. Острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) становятся причиной примерно 10% всех случаев эпилепсии и 55% впервые выявленных приступов у пожилых людей. В большинстве случаев инсульты происходят у людей старше 45 лет. До 90% инсультов являются ишемическими (ИИ), а остальные 10% – геморрагическими [1][2].

Постинсультная эпилепсия (ПИЭ), одна из форм приобретенной структурной эпилепсии, может вызывать осложнения, которые ухудшают качество жизни, повышают смертность и увеличивают затраты на медицинскую помощь [3]. Примерно у 10% людей, перенесших инсульт, развивается ПИЭ. Учитывая значительное бремя инсульта во всем мире, ПИЭ является серьезной проблемой [2]. Кроме того, 40% случаев позднего начала эпилепсии связаны с цереброваскулярными заболеваниями, и эпилепсия с поздним началом часто сопровождается рецидивом ОНМК, что показывает важность данного вопроса как на глобальном, так и на национальном уровне.

Риск развития эпилепсии увеличивается у людей с отдаленными последствиями ИИ [4][5]. Ранние эпилептические приступы наблюдаются в течение первых 2 дней после инсульта, в то время как поздние приступы могут проявляться между 6-м месяцем и 1-м годом после инсульта, согласно исследованию М.Y. Xu (2018 г.) [6]. Первоначальные приступы, как правило, возникающие в течение первых 7 дней острого периода инсульта, поздние приступы (с 8-го по 21-й день острой стадии инсульта) и предвестники (приступы, предшествующие инсульту) систематизируются в соответствии с классификацией G.S. Barolin (1962 г.) [7]. По данным A. Pezzini et al. (2024 г.) [1], H. Stefan и G. Michelson (2024 г.) [4], после инсульта частота ранних эпилептических приступов у пациентов колеблется от 2–33% до 50–78%, а поздних постинсультных приступов – от 3–4,5% до 67%. Однако их роль в развитии ПИЭ недостаточно изучена. До сих пор остаются неясными механизмы формирования ПИЭ, основные предикторы постинсультных эпилептических приступов и роль различных биомаркеров в их патогенезе и исходе заболевания.

На развитие эпилепсии после ОНМК могут указывать различные биомаркеры, которые можно измерить. При биологическом процессе нейровоспаления высвобождаются воспалительные медиаторы, такие как простагландины, хемокины, цитокины, компоненты комплемента, факторы роста и молекулярные паттерны, связанные с повреждением (англ. damage-associated molecular patterns, DAMPs) [8–10]. Повышенная возбудимость, изменения в синаптической передаче, глиоз, нарушение функции гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и аномальный нейрогенез – все это последствия длительного нейровоспаления [11–14]. Изменения концентрации биомаркеров в крови могут указывать на наличие или развитие заболевания [15][16], а некоторые из них обладают нейропротекторными свойствами [16][17], поэтому их исследование является актуальным.

Для диагностики различных нейродеструктивных заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), таких как эпилепсия, исследование нейронспецифической енолазы (англ. neuron-specific enolase, NSE) стало перспективным направлением в нейроиммунологии. В исследовании Г.С. Рахимбаевой и Н.С. Рашидовой (2011 г.) было обнаружено, что уровень NSE в сыворотке крови пациентов с посттравматической эпилепсией выше, чем у больных с сосудистой эпилепсией [18]. Пациенты с более частыми приступами имели самые высокие значения NSE. Это особенно верно для молодых людей, о чем сообщается также в работах X. Bai еt al. (2022 г.) [19], H. Eriksson еt al. (2021 г.) [20].

Фактор роста эндотелия сосудов (англ. vascular endothelial growth factor, VEGF) – еще одна молекула, связанная с дисфункцией ГЭБ в головном мозге [16, 21–23]. Ангиогенез, процесс образования новых сосудов из ранее существовавших, может наблюдаться как при физиологических (т.е. при развитии), так и при патологических состояниях [24]. В основе формирования и прогрессирования сосудистых пороков (мальформаций) лежит локальная сверхэкспрессия VEGF [25–27]. V. Rigau et al. (2007 г.) установили, что плотность сосудов в гиппокампе у пациентов с эпилепсией примерно в два раза выше, чем в гиппокампе у неэпилептических контрольных групп [22]. Однако остается неясным, каким образом VEGF-индуцированная дисфункция ГЭБ влияет на развитие эпилепсии и эпилептических приступов.

Таким образом, в связи с прогрессом в лечении пациентов, перенесших инсульт, распространенность ПИЭ увеличивается. Важное практическое значение имеют настороженность по поводу возникновения ПИЭ, ее профилактика и ранняя диагностика. Поиск биомаркеров, определяющих прогноз осложнений ИИ и развития ПИЭ, с разработкой протокола диагностики представляет научный и практический интерес.

Цель – исследование уровней NSE и VEGF в сыворотке крови пациентов с ПИЭ, изучение клинико-нейроиммунологических корреляций.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ / MATERIAL AND METHODS

В период с 2020 по 2024 гг. в многопрофильной клинике Ташкентской медицинской академии и Городской клинической больнице № 7 г. Ташкента (Узбекистан) было проведено исследование с участием 170 пациентов в возрасте от 28 до 84 лет.

Критерии включения и исключения / Inclusion and exclusion criteria

При составлении когорты исследования учитывали следующие критерии включения:

– возраст старше 18 лет;

– поздний восстановительный период и период остаточных явлений ИИ (для групп с ИИ).

Критерии исключения из исследования:

– детский и подростковый возраст;

– острейший и острый период ИИ;

– геморрагический инсульт;

– гипертонические кризы и транзиторные ишемические атаки;

– эпилепсия, предшествовавшая инсульту;

– опухоли, травмы головного мозга;

– токсические поражения;

– клиническая смерть;

– воспалительные заболевания головного мозга (менингиты, менингоэнцефалиты, энцефалиты, лептоменингиты, лейкодистрофии, нейросифилис, синдром Гийена–Барре);

– демиелинизирующие заболевания головного мозга (рассеянный склероз, рассеянный энцефаломиелит, миастении, полинейропатии);

– психические нарушения.

Группы пациентов / Patient groups

Пациенты, перенесшие ИИ, были разделены на две группы в зависимости от того, диагностирована у них эпилепсия или нет.

В основную (1-ю) группу вошли 70 пациентов (42 (60%) мужчины и 28 (40%) женщин) с поздними эпилептическими приступами после первого ИИ. Возраст больных составил 62,95±9,98 года (от 28 до 79 лет, медиана 63 года).

Группу сравнения (2-ю) составили 70 пациентов (51 (72,86%) мужчина и 19 (27,14%) женщин) с последствиями ИИ без эпилептических приступов. Средний возраст составил 62,24±11,55 года (от 30 до 84 лет, медиана 62 года).

В контрольную группу включены 30 пациентов (9 (42,9%) мужчин и 12 (57,1%) женщин) с астено-невротическим синдромом и дорсопатией, у которых не было ИИ, эпилепсии или других серьезных соматических и неврологических заболеваний. Средний возраст составил 55,18±10,48 года (от 45 до 59 лет, медиана 55 лет).

Диагностика / Diagnostics

Пациентам выполняли нейровизуализацию (магнитно-резонансную томографию (МРТ) и компьютерную томографию (КТ) головного мозга), нейрофизиологическое исследование (электроэнцефалографию (ЭЭГ)), а также клиническое и неврологическое обследование на момент первичного осмотра с последующим наблюдением в течение 6–12 мес.

МРТ-исследование проводили на аппарате Phillips American G (напряженность магнитного поля 1,5 Тл) в режимах Т1, Т2, FLAIR, FSE-axial, FSE-coronar, Т2*/SWI, DWI. Бесконтрастную КТ и КТ-перфузию выполняли на мультиспиральном компьютерном томографе Revolution 128 (Philips, Голландия) путем передне-заднего сканирования с толщиной среза 2,5 мм. Исследования проводили в частной клинике «Медион» г. Ташкента. Всем пациентам выполняли запись ЭЭГ на 19-канальной системе «Нейрон-Спектр-3» (ООО «Нейрософт», Россия).

Формулировку диагноза ИИ и его последствий осуществляли в соответствии с Международной классификацией болезней 10-го пересмотра (МКБ-10) (код I69.3 для последствий ИИ), общепринятыми рекомендациями, такими как руководящие документы Европейской организации инсульта (англ. European Stroke Organisation, ESO) [28] и Международной Противоэпилептической Лиги (МПЭЛ; англ. International League Against Epilepsy, ILAE) [29][30].

Для классификации эпилептических приступов и эпилепсии использовали рабочую классификацию типов приступов и дефиницию эпилепсии, представленные ILAE в 2017 г. [29][30]. Также для установления диагноза эпилепсии применяли МКБ-10, где эпилепсия обозначена кодом G40.

Методы оценки / Assessment methods

Для оценки степени тяжести ИИ использовали шкалу инсульта Национальных институтов здравоохранения США (англ. National Institutes of Health Stroke Scale, NIHSS), степени инвалидизации – модифицированную шкалу Рэнкина (англ. modified Rankin Scale, mRS), эффективности ухода и базовой функциональной активности пациента – индекс Бартела (англ. Barthel Index, BI).

С целью прогнозирования поздних приступов после ИИ применяли шкалу SeLECT (англ. SEverity of stroke, Large artery atherosclerosis, Early seizure, Cortical involvement, Territory of the middle cerebral artery) [31]. Этот инструмент может помочь в профилактике поздних эпилептических приступов после инсульта. В оценке учитываются ранние приступы, тяжесть инсульта (11 баллов и выше по NIHSS), а также поражение корковых зон и артериальных бассейнов, включая кору головного мозга, зону средней мозговой артерии и атеросклеротическое поражение крупных артерий. Шкала позволяет оценить вероятность того, что перенесшие инсульт пациенты будут испытывать приступы в течение 5 лет. Ранний приступ, который не классифицируется как эпилепсия, не указывает на ПИЭ. Хотя существует связь между ранними приступами и повышенным риском развития эпилепсии в будущем, это не является основанием для постановки диагноза ПИЭ [31]. Исследования E. Beghi et al. (2011 г.) [32] и M. Holtkamp et al. (2017 г.) [33] показали, что эпилептический приступ, возникший более чем через 1 нед после инсульта, классифицируется как поздний и неспровоцированный и значительно повышает вероятность повторных приступов (более чем на 60%).

Для оценки степени тяжести течения эпилепсии использовали классификацию K. Lühdorf et al. (1986 г.): мягкое течение (легкая степень тяжести) – 3 и менее эпилептических приступов в год, средняя степень – 12 и менее приступов в год, тяжелое течение (тяжелая степень тяжести) – 13 и более приступов в год [34].

Иммуноферментный анализ / Enzyme-linked immunosorbent assay

Помимо стандартных анализов в образцах сыворотки крови всех наблюдавшихся пациентов основной группы и группы сравнения, перенесших ИИ более 6 мес назад, а также контрольной группы с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) определяли уровни NSE с использованием набора реагентов «HCE-ИФА» (ООО «Хема», Россия) и VEGF с использованием набора реагентов VEGF-ИФА-БЕСТ (АО «Вектор-Бест», Россия) по инструкции производителей.

Статистический анализ / Statistical analysis

Сначала данные были занесены в регистрационные карты каждого пациента, а затем перенесены в электронную базу данных Excel 2010 (Microsoft, США). Для анализа использовали традиционные методы вариационной статистики. Результаты представлены с помощью среднего значения и стандартного отклонения (M±SD), возраст – дополнительно в виде медианы и диапазона значений. После проверки нормальности распределения данных количественные показатели оценены с применением t-критерия Стьюдента, а качественные – с помощью критерия χ². Расчет коэффициента корреляции Пирсона (r) использовали для оценки взаимосвязи между двумя выборочными совокупностями. Статистически значимую разницу определяли как не менее 95% (p<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ / RESULTS AND DISCUSSION

Оценка по шкалам / Assessment by scales

Результаты применения оценочных шкал в обеих группах больных с ИИ представлены в таблице 1.

Тяжесть инсульта

В основной группе значение по шкале NIHSS достигло 20,1±4,0 балла, что в 1,04 раза выше, чем в группе сравнения, в которой суммарный балл составил 19,37±4,46 (р=0,3) (табл. 2). В 1-й группе у 22,86% пациентов был диагностирован легкий ИИ (средний балл по шкале NIHSS 9,69±2,90), у 35,71% – среднетяжелый (средний балл 18,36±1,65), у 41,43% – тяжелый (средний балл 27,46±5,93). Во 2-й группе у 27,14% больных отмечен легкий ИИ (средний балл 12,00±2,93), у 45,72% – среднетяжелый (средний балл 19,00±1,30), у 27,14% – тяжелый (средний балл 24,68±4,07). Таким образом, тяжелый ИИ чаще встречался у пациентов с ПИЭ (р<0,05).

Степень инвалидизации

При использовании шкалы mRS больные с ИИ и ПИЭ показали следующие результаты по уровню инвалидизации по сравнению с пациентами без ПИЭ: 3,00±1,00 и 2,27±0,96 балла соответственно (р<0,001) (см. табл. 1). У больных с ПИЭ определена значимо более высокая балльная оценка по mRS, чем у пациентов без ПИЭ. Пациенты без ПИЭ не нуждались в постороннем уходе (<3 баллов по mRS), в то время как пациенты с ПИЭ - нуждались (≥3 баллов по mRS). Таким образом, можно сделать вывод, что эпилепсия ухудшает состояние больных с инсультом.

Активность в повседневной жизни

Показатели индекса Бартела для оценки активности в повседневной жизни составили в среднем 65,0±12,65 балла в 1-й группе и 65,6±9,32 балла во 2-й группе (см. табл. 1), что свидетельствует об умеренной зависимости от окружающих в повседневной жизни. Исследуемые группы по данному критерию статистически значимо не отличались (р=0,7).

Риск развития поздних приступов

По шкале SeLECT до лечения средний балл в 1-й группе составил 3,41±1,30, во 2-й группе – 2,94±1,30 (р=0,03) (см. табл. 1). Исследуемые группы по данному критерию значимо отличались в 1,16 раза, что может свидетельствовать о более высоком риске развития поздних приступов при ИИ с учетом наличия вышеперечисленных критериев.

Степень развития эпилепсии

У 32 (45,71%) пациентов была легкая степень тяжести ПИЭ, у 12 (17,14%) – средняя (р<0,001), у 26 (37,15%) – тяжелая (р<0,05) (рис. 1). Принимая во внимание то, что классификация K. Lühdorf et al. учитывает только частоту и не учитывает форму эпилептических приступов (простые парциальные, сложные парциальные, генерализованные или вторично-генерализованные), безусловно, более тяжелое течение ПИЭ отмечалось у больных с высокой частотой, в первую очередь, генерализованных форм приступов и эпилептического статуса. Итак, среди данной выборки пациентов с ПИЭ наиболее часто регистрировались легкая и тяжелая степени тяжести течения ПИЭ, зависящие от частоты и формы эпилептических приступов.

Иммуноферментный анализ / Enzyme-linked immunosorbent assay

Уровень NSE

На следующем этапе изучали уровень NSE в сыворотке крови больных. В исследованном периоде ИИ выявлено увеличение концентрации NSE. Показатели составили в среднем 18,42±3,00 нг/мл в 1-й группе и 17,34±3,37 нг/мл во 2-й группе, т.е. по сравнению с контрольной группой (3,9±1,3 нг/мл) – повышение в 4,72 и 4,45 раза соответственно (р<0,001) (табл. 3).

При этом уровень NSE в 1-й группе превышал таковой во 2-й группе в 1,06 раза (р=0,04) (рис. 2). Максимальные значения NSE наблюдались у больных со среднетяжелым и тяжелым ИИ в обеих группах (р<0,05). Это свидетельствует о том, что данный биомаркер является предвестником неврологического дефицита и развития эпилепсии после перенесенного ИИ.

В результате проведенного корреляционного анализа уровней NSE и баллов по оценочным шкалам у больных с ПИЭ выявлена прямая сильная связь между показателями NSE и баллами по шкале NIHSS (r=0,71) (рис. 3а). Это может означать, что повышение уровня NSE является маркером тяжелого течения ИИ и неблагоприятного прогноза у пациентов с ПИЭ.

У больных с ПИЭ может наблюдаться умеренная прямая связь между концентрацией NSE и баллами по шкале mRS (r=0,50) (рис. 3b), и ее дальнейший рост может негативно влиять на реабилитационный период.

Выявлена слабая корреляционная связь между показателями NSE и баллами по индексу Бартела (r=0,31) (рис. 3с), который указывает на активность и зависимость больного в повседневной жизни. Следовательно, высокий уровень NSE может опосредованно влиять на активность больных с ПИЭ за счет тяжести неврологического дефицита. Наши результаты согласуются с данными других исследователей [18][35].

Коэффициент корреляции между уровнем NSE и баллами по шкале SeLECT составил r=0,88, т.е. определена прямая сильная связь (рис. 3d). Принимая во внимание, что наименьшее значение шкалы может предсказывать риск поздних приступов в течение 1 года после инсульта 0,7%, риск в течение 5 лет – 1,3%, тогда как наивысшее значение (9 баллов) означает риск поздних приступов в течение 1 года 63%, в течение 5 лет – 83% [31], а также то, что чем выше баллы по шкале, тем выше уровень NSE, и наоборот, можно сделать вывод о валидности данной шкалы и исследованного биомаркера как предикторов риска развития поздних эпилептических приступов после ИИ.

NSE относится к внутриклеточным энзимам ЦНС и представляет собой изоформу фермента енолазы, который необходим для гликолиза. Этот маркер используется для оценки дифференцированности ЦНС и является одним из наиболее специфичных индикаторов повреждения нейронов. Начиная с синаптогенеза, т.е. после 22-й недели беременности, NSE начинает проявляться на более поздних стадиях нейрональной дифференциации. Этот уникальный сывороточный маркер также может использоваться для выявления новообразований нервной ткани и нейроэндокринных опухолей [35]. При ишемическом повреждении, травме мозга, эпилепсии и в результате субарахноидального кровоизлияния наблюдается повышение уровня NSE в сыворотке крови [36][37].

Таким образом, у пациентов с последствиями инсульта и эпилептическими приступами отмечается повышенная в 1,06 раза концентрация NSE в сыворотке крови в сравнении с больными с ИИ без эпилепсии и в 4,72 раза – в сравнении с контрольной группой, что свидетельствует о более значительном разрушении нервной ткани у пациентов с ПИЭ. Следовательно, использование NSE как маркера повреждения мозга может улучшить диагностику и прогнозирование исхода ПИЭ.

Уровень VEGF

ИФА-исследование концентрации VEGF в сыворотке крови больных показало его статистически значимое повышение в 1,59 раза в основной группе (286,75±17,40 пг/мл) и в 1,54 раза в группе сравнения (278,20±12,08 пг/мл) относительно контрольных значений (180,1±2,1 пг/мл) (р<0,001) (см. табл. 3).

При этом уровень VEGF в 1-й группе статистически значимо превышал таковой во 2-й группе – в 1,03 раза (p<0,001) (рис. 4). Также показано, что гиперэкспрессия VEGF чаще встречается у пациентов с эпилепсией и энцефалопатией. Это означает, что VEGF участвует не только в ангиогенезе (формировании новых сосудов из уже существующих), но и в эпилептогенезе. Сосудистая эпилепсия связана с его гиперэкспрессией. На роль VEGF в патогенезе эпилепсии указывают также другие авторы [21][22].

Корреляционный анализ показал слабую прямую связь (r=0,47) между уровнем VEGF и баллами по шкале NIHSS (рис. 5а), что говорит о незначительной связи гиперэкспрессии VEGF с тяжестью ИИ. О двойственной роли VEGF в патогенезе ИИ сообщают также другие авторы, в работах которых гиперэкспрессия VEGF имеет компенсаторный характер в остром периоде заболевания, способствуя росту новых сосудов [16][24].

Установлено, что показатели степени инвалидизации по шкале mRS у пациентов с ПИЭ имеют слабую положительную корреляционную взаимосвязь (r=0,44) с уровнем VEGF (рис. 5b), что может указывать на то, что данный маркер слабо взаимосвязан со степенью инвалидизации и реабилитационным потенциалом больных с ПИЭ.

Доказана слабая корреляционная связь между показателями VEGF и баллами по индексу Бартела (r=0,33) (рис. 5с) и шкале SeLECT (r=0,40) (рис. 5d). Так, высокий уровень VEGF не взаимосвязан с развитием поздней эпилепсии после ИИ, а также с активностью больных в повседневной жизни. Кроме того, этот показатель не имеет никакой значимости для прогнозирования развития или усугубления эпилепсии в исследуемый период после инсульта.

Для изучения взаимосвязи уровней VEGF и NSE при ПИЭ проведен корреляционный анализ, показавший слабую прямую корреляционную связь (r=0,38) (рис. 6).

Гиперэкспрессия VEGF лежит в основе формирования и прогрессирования таких сосудистых пороков, как артериовенозные мальформации (АВМ) [25]. При АВМ гиперэкспрессия VEGF обнаруживается в астроцитах, нейронах и эндотелиальных клетках. Следовательно, эти клетки могут секретировать VEGF для поддержки ангиогенеза и формирования АВМ [21][25], хотя прямые доказательства, подтверждающие эту гипотезу, отсутствуют.

Ангиогенез в мозге больного эпилепсией коррелирует с дисфункцией ГЭБ, связанной с VEGF [21]. Матричные РНК VEGF и его рецептора 2 (англ. vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2) были активированы, а ZO-1, который является белком, связанным с плотным соединением, был понижен в культурах срезов, обработанных каиновой кислотой [26]. Лечение антителами против VEGF ослабляло увеличение плотности сосудов и числа сосудистых ветвей, а также снижение экспрессии ZO-1. Кроме того, обнаружено, что передача сигналов VEGF/VEGFR2, вероятно, индуцирует ангиогенез и дисфункцию ГЭБ через протоонкоген-тирозинкиназный путь Src [21][26].

Эндотелиальные клетки экспрессируют VEGFR, и в нескольких источниках высказано предположение, что матриксная металлопротеиназа активирует сигнальный путь VEGF/VEGFR в ангиогенезе при патологических состояниях [21][26][27]. Однако вопрос о том, способствуют ли эти системы ангиогенезу в мозге пациента с эпилепсией и каким образом, еще предстоит изучить.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

Таким образом, нами доказано, что гиперэкспрессия NSE, являющегося маркером повреждения мозга, имеет значение в диагностике и прогнозировании исхода ПИЭ. Гиперэкспрессия VEGF играет двойственную роль в патогенезе ПИЭ в зависимости от периода ИИ и наличия эпилепсии, с компенсаторным характером в остром периоде ИИ и неблагоприятным показателем в периоде отдаленных последствий, особенно при развитии сосудистой и структурной эпилепсии, что может указывать на его роль в эпилептогенезе.

Определены корреляционные взаимосвязи между показателями, которые характеризуют повреждение нервной ткани и процесс ангиогенеза, и степенью тяжести, инвалидизации, реабилитационного потенциала, активности пациентов в повседневной жизни. Также показана прогностическая значимость гиперэкспрессии NSE и VEGF в развитии и ухудшении течения эпилепсии у пациентов с эпилептическими приступами и последствиями инсульта. Можно предсказать развитие или прогрессирование эпилепсии, опираясь на уровни этих биомаркеров после инсульта.