Изучение нейротропных свойств новых противоэпилептических азотсодержащих препаратов

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

По данным Всемирной организации здравоохранения, сейчас в мире около 50 млн человек страдают эпилептиформными нарушениями. В последние годы арсенал противосудорожных средств ощутимо расширился. Благодаря этому терапия больных эпилепсией стала более дифференцированной, избирательной и индивидуальной.

Современная фармакотерапия эпилепсий и эпилептических синдромов осуществляется за счет противосудорожных и противоэпилептических препаратов (ПЭП) с инновационными механизмами действия на мишени патологической эпилептической системы [1–3]. С точки зрения механизма действия фармакотерапия направлена на регуляцию нейротрансмиттерных белков-мишеней, обеспечивающих процесс переноса анионов и катионов, который способствует снижению электроактивности клеток. Одним из таких механизмов является коразоловый путь действия – он приводит к угнетению нейротрансмиттера гамма-аминомасляной кислоты А (англ. gamma-aminobutyric acid А, GABA_А), играющего важную роль в процессах сигналинга [4]. С другой стороны, транспортер серотонина (англ. serotonin transporter, SERT) и рецептор 5-HT1А вовлечены в моноаминогенный путь эпилептогенеза [5].

Мы провели экспериментальное исследование нейротропного действия новых противосудорожных азотсодержащих соединений, синтезированных в Институте тонкой органической химии ГНКО «Научно-технологический центр органической и фармацевтической химии» Национальной академии наук Республики Армения (НАН РА).

Цель – в экспериментальном исследовании оценить эффективность новых азотсодержащих соединений для купирования эпилептиформных состояний и провести молекулярное моделирование нового нейротропного препарата.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ / MATERIAL AND METHОDS

Препараты сравнения / Comparators

Выполняли изучение нейротропной активности шести новых синтезированных в Институте тонкой органической химии ГНКО «Научно-технологический центр органической и фармацевтической химии» НАН РА соединений – производных различных азотсодержащих препаратов – № 1 (производное бензотиенопиримидина, N3212), № 2 (производное пиридoпиримидина), № 3 (производное триазолопиридина), № 4 (литиевое производное дилантина (5,5-дифенилгидантоина), № 5 (производное тиеноизохинолина) и № 6 (производное пиранопиридина).

Сравнение проводили с пуфемидом, синтезированным в 1980-х гг. в Институте тонкой органической химии НАН РА, а также с применяемыми в лечебной практике известными препаратами этосуксимид и диазепам [6].

Дозировки / Dosages

Исследуемые соединения вводили в диапазоне доз 12,5–100 мг/кг, препарат сравнения диазепам – в дозах 0,1–2,0 мг/кг, пуфемид – в дозе 200 мг/кг, этосуксимид – в дозах 150–300 мг/кг внутрибрюшинно за 45 мин до введения коразола в виде суспензии с карбоксиметилцеллюлозой и твин-80.

Тесты / Tests

Опыты выполняли на 300 белых аутбредных мышах-самцах массой 18–24 г и 48 крысах-самцах массой 120–150 г. Противосудорожный спектр действия исследовали по тестам «коразоловые судороги», «максимальный электрошок» [7–10]. Психотропные свойства соединений изучали по тестам «приподнятый крестообразный лабиринт», «открытое поле», «конфликтная ситуация». Нейротоксические эффекты соединений оценивали по нарушению координации движений в тесте «вращающийся стержень» [7][11–15].

Седативное, активирующее и противотревожное действие отобранных наиболее активных соединений изучали на крысах в тесте «открытое поле». Регистрацию спонтанного поведения у каждого отдельного животного осуществляли в течение 5 мин. О наличии седативного и активирующего действия судили по количеству горизонтальных (пересечения квадратов) и вертикальных (подъемы на задние лапы) перемещений.

Анксиолитический эффект препарата оценивали в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» на мышах по увеличению числа заходов в открытые рукава и времени нахождения в них, без увеличения общей двигательной активности. При этом фиксировали время, проведенное в закрытых, открытых рукавах установки, в центре и количество заходов в закрытые рукава установки.

Исследовали также транквилизирующее действие соединений на модели «конфликтная ситуация». Конфликтную ситуацию у крыс создают путем столкновения двух мотиваций – питьевой и оборонительной. О наличии анксиолитического эффекта свидетельствует увеличение взятий воды, несмотря на получение электроболевого раздражения.

Компьютерный анализ / Computer analysis

In silico исследованиe с использованием методов молекулярного докинга и компьютерного анализа проведено с применением различных мишеней. Молекулярные модели исследуемых соединений получены с помощью программного пакета Chem Office (PerkinElmer, США) [17]. Молекулярные модели исследуемых мишеней взяты из базы данных RCSB с идентификационными номерами SERT Transporter, GABA_А receptor, 5-HT1А receptor.

Статистический анализ / Statistical analysis

Результаты экспериментов были статистически обработаны путем расчета их эффективных 50% доз (ЭД₅₀), летальных 50% доз (ЛД₅₀) и нейротоксических 50% доз (ТД₅₀). Расчеты данных показателей и доверительных интервалов проводили методом пробит-анализа по Litchfield и Wilcoxon [16]. Количественные данные представлены в виде среднего арифметического и ошибки среднего арифметического (М±m). Пороговым значением, при котором результат признавали статистически значимым, считали значение p≤0,05.

Терапевтический индекс (ТИ) определяли по формуле:

ТИ = ЛД₅₀/ЭД₅₀.

Защитный индекс (ЗИ) рассчитывали по формуле:

ЗИ = ТД₅₀/ ЭД₅₀.

Этические аспекты / Ethical aspects

Исследования проводили согласно правилам Европейской конвенции о защите животных, используемых в экспериментах (Директива 2010/63/EU), уход за животными и их содержание осуществляли в соответствии с рекомендациями руководства по содержанию и использованию лабораторных животных [18].

РЕЗУЛЬТАТЫ / RESULTS

Противосудорожное действие и токсичность / Anticonvulsant effect and toxicity

Как показано в таблице 1, соединения №№ 1, 2, 3, 5 и 6 имеют выраженный антикоразоловый эффект и превосходят функциональные аналоги (пуфемид и этосуксимид) в несколько раз. По остальным судорожным тестам соединения проявляют слабовыраженное действие. Соединение № 4 оказывает выраженное антиэлектрошоковое действие (оно является литиевым производным известного ПЭП фенитоин).

Изученные соединения малотоксичны и имеют высокие ТИ и ЗИ (см. табл. 1). По антикоразоловой активности все они уступают диазепаму, однако диазепам вызывает миорелаксацию в очень низких дозах, в отличие от исследованных соединений, и имеет низкий ЗИ.

Соединение № 1 наиболее активно (ЭД₅₀ = 16 мг/кг) по антагонизму с коразолом. Оно статистически достоверно превосходит этосуксимид в 10 раз и пуфемид в 5 раз. Соединение является наименее токсичным (ЛД₅₀ = 2300 мг/кг) и имеет низкую нейротоксичность (ТД₅₀ = 660 мг/кг). ТИ и ЗИ соединения превосходят этосуксимид в 17 и 13 раз, а пуфемид – в 6 и 8 раз соответственно.

Психотропные свойства / Psychotropic effects

В тесте «открытое поле» (табл. 2) соединение № 1 в дозе 50 мг/кг уменьшает число горизонтальных перемещений животных по сравнению с контрольной группой с 24,2 до 14,2, вертикальных перемещений – с 5,6 до 2,8, a количество обследованных ячеек увеличивается от 0,5 до 3,6. Аналогичный эффект дают соединение № 4 в дозе 25 мг/кг и пуфемид в дозе 200 мг/кг. Все остальные изученные соединения в тех же условиях, что и диазепам, приводят к увеличению количества горизонтальных перемещений и обнюхивания ячеек, а этосуксимид не дает эффекта.

Таким образом, изучение исследовательской активности указывает на то, что соединения №№ 1 и 4 вызывают некоторый седативный эффект, уменьшaя двигательную активность животных, в отличие от диазепама и всех остальных соединений (№№ 2, 3, 5, 6), которые оказывают активирующее действие. Одновременно все отобранные соединения, как и диазепам, увеличивают количество обследованных ячеек, что указывает на антитревожное действие веществ. Все отобранные соединения статистически значимо увеличивают число взятий воды, несмотря на электроболевое раздражение, т.е. проявляется анксиолитическое действие. Такой же эффект наблюдается у диазепама и пуфемида, в отличие от этосуксимидa. Число взятий воды на модели «конфликтная ситуация» увеличивается от 2,5 (контроль) до 14,6 в случае соединения № 1. Фактически, как соединение № 1, так и все изученные соединения проявляют транквилизирующее действие.

На экспериментальной модели «приподнятый крестообразный лабиринт» введение соединения № 1 в дозах 50 и 100 мг/кг сопровождается у животных отсутствием эффекта страха (животные достаточно времени проводят в открытых рукавах), в отличие от контроля, где присутствует феномен страха. Соединение № 1 в дозе 100 мг/кг уменьшает время нахождения мышей в темных рукавах от 257 до 5,6 с и увеличивает время в открытых рукавах до 58 с (табл. 3).

Число входов в темные рукава не меняется по сравнению с контролем после введения этосуксимидa, пуфемида, диазепама. Соединение № 1 в дозах 50 и 100 мг/кг уменьшает число входов в темные рукава, увеличивает время нахождения в центре. Это может свидетельствовать о появлении некой защитной реакции «против страха и безысходности». Аналогичная картина наблюдается и с препаратами №№ 2, 3, 5, 6 в дозе 50 мг/кг, № 4 в дозе 25 мг/кг и у диазепама в дозе 2 мг/кг. Пуфемид и этосуксимид не обладают таким свойством. Время нахождения в открытых рукавах указывает, что все отобранные соединения обладают анксиолитическим действием, которое особенно выражено у соединения № 3 (88 с).

Докинг-исследование / Docking research

Исходя из полученных результатов исследований указанных нейротропных препаратов, молекулярный докинг был проведен с применением различных мишеней (GABA_A, 5-HT1А и SERT) с наиболее активным соединением № 1 (N3212).

Соединение N3212, по сути, взаимодействует со всеми исследуемыми мишенями, но при этом является уникальным для SERT и 5-HT1А, в основном проявляя избирательный характер взаимодействия. С SERT наблюдаются как гидрофобные, так и электростатические типы связей, что может привести к стабильному комплексообразованию. Необходимо отметить, что водородных связей при построении конформационных карт не обнаружено. Наблюдается также образование сульфидного мостика с Phe341, который является одним из ключевых аминокислотных остатков активного центра SERT (рис. 1).

На рисунке 2 представлены результаты комплекса соединения N3212 с 5-HT1А, где визуализируются в основном гидрофобные взаимодействия. Что касается водородной связи, то рассчитанная дистанция связи является максимальной, для верификации данной связи необходимы дополнительные исследования.

Таким образом, можно констатировать, что соединение N3212 взаимодействует с рецепторами 5-HT1А, SERT и GABA_А, что указывает на совпадение in silico исследований с результатами in vivo исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

Выявлены новые соединения, синтезированные в ГНКО «Научно-технологический центр органической и фармацевтической химии» НАН РА и обладающие противосудорожным, анксиолитическим, психоседативным или активирующим действием одновременно. Отобранные соединения по многим исследованным показателям превосходят некоторые применяемые в медицинской практике психотропные препараты и перспективны для дальнейшего изучения и последующего внедрения в качестве ПЭП с психотропными свойствами.

На основе полученных пространственно-энергетических значений и конформационных карт соединения N3212 определено, что оно взаимодействует с рецепторами SERT, 5-HT1А и GABA_А, что указывает на совпадение in silico исследований с результатами in vivo исследований.