Изучение эффектов органической и неорганической солей лития на модели первично-генерализованных судорог у крыс

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

Результаты фундаментальных и клинических исследований указывают на перспективы применения препаратов лития не только в психиатрической практике, но и в неврологии, в первую очередь для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний. Общеизвестно, что высокодозная терапия карбонатом лития (г/сут) – основа лечения биполярного расстройства. Хорошо изучены молекулярные механизмы действия лития (ингибирование феркиназы-гликоген-синтентазы-3β и инозитолмонофосфатазы с последующей активацией нейропротекторных и нейротрофических каскадов). Исследования последнего десятилетия сосредоточены на влиянии лития на регуляцию аутофагии, процессы накопления в нейронах патологических белков, таких как β-амилоид и τ-протеин [1].

Фундаментальные исследования и наблюдения за пациентами показали, что нейропротекция ионами лития при ишемии [2] и нейротрофические эффекты при нейродегенерации связаны с повышением уровней нейротрофического фактора мозга (англ. brain-derived neurotrophic factor, BDNF) и нейротрофина-3 (англ. neurotrophin-3, NT-3) в головном мозге [3]. Кроме того, ионы Li+ активируют тропомиозин-рецептор киназы В (англ. tropomyosin receptor kinase B, TrkB) фактора роста нервов, усиливая адаптивность нейронов к глутаматному стрессу [4]. Показана ассоциация дефицита лития с боковым амиотрофическим склерозом [5].

Отдельной научной проблемой является поиск безопасных и эффективных солей лития [1]. По данным фундаментальных исследований, органические соли лития (например, аскорбат лития (LiAsc) или цитрат лития) эффективно всасываются нейронами и позволяют поддерживать устойчивые уровни Li+ в биосубстратах (в т.ч. в крови и нервной ткани). Нейроцитологические исследования, в частности, продемонстрировали адаптогенное действие LiAsc на нейроны в условиях глутаматного стресса in vitro при отсутствии таковых у карбоната лития [6].

Цель – изучить влияние LiAsc и карбоната лития в различных дозах per os на выраженность и тяжесть течения у крыс первично-генерализованных судорог, вызванных тиосемикарбазидом in vivo.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ / MATERIAL AND METHODS

Группы животных / Animal groups

Исследование проведено на 30 белых крысах-самцах линии Вистар массой 200–300 г. Крысы получены в Питомнике лабораторных животных «Белый мох» Научного центра биомедицинских технологий Российской академии медицинских наук (Московская обл., Электрогорск). Эксперименты проводились на базе кафедры фармакологии ФГБОУ ВО «Ивановский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Животные были разделены на пять групп:

• 1-я группа (n=6) – контроль с воспроизведением первично-генерализованных судорог [7];
• 2-я группа (n=6) получала карбонат лития в дозе 5 мг/кг массы крысы в сутки per osвнутрижелудочно;
• в 3-й группе (n=6) вводили LiAsc в дозе 5 мг/кг/сут зондированием per os;
• в 4-й группе (n=6) вводили LiAsc в дозе 10 мг/кг/сут зондированием per os;
• в 5-й группе (n=6) вводили LiAsc в дозе 15 мг/кг/сут зондированием per os.

Эксперимент проводили в течение 14 сут.

Модель судорог / Seizure model

Как описано ранее в работе [8], для определения противосудорожных свойств веществ воспроизводят экспериментальные модели первично-генерализованной эпилепсии, включающие судороги, вызванные электрическим и химическим воздействием.

В экспериментальных группах модель судорог была воспроизведена внутрибрюшинным введением тиосемикарбазида в дозе 28 мг/кг. При этом во всех группах регистрировали латентное время до первого приступа, количество, характер судорог (вздрагивание, манежный бег, клонические судороги, тонико-клонические судороги с боковым положением, тоническая экстензия и тоническая экстензия, заканчивающаяся гибелью), а также летальность в течение 90 мин.

Патогистологический анализ / Histopathological analysis

Патогистологическое исследование с окраской гематоксилином/эозином и серебром по методу Ниссля проводили на анализаторе изображения BioVision (Австрия) в 10 различных полях зрения, как описано в работе [8]. После краниотомии головной мозг извлекали целиком и фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, через 1 сут с помощью фронтальных разрезов выделяли зону прецентральной извилины переднего мозга, мозжечок, ствол головного мозга. Проводку нервной ткани осуществляли по стандартной схеме (обезвоживание в этиловом спирте, ксилоле) с последующим изготовлением парафиновых блоков. Изготовленные на санном микротоме Microm (Германия) гистологические срезы толщиной 5–6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Дубликаты срезов с помощью набора реактивов ООО «БиоВитрум» (Россия) были окрашены по методу Ниссля и импрегнированы серебром.

Морфометрическое исследование гистологических срезов, выполненное на анализаторе изображения BioVision (Австрия), заключалось в подсчете поврежденных нейроцитов пирамидного слоя коры полушарий переднего мозга в 10 различных полях зрения с последующей статистической обработкой результатов. Микрофотографии получены с помощью исследовательского микроскопа Micros (Австрия) и цифровой окулярной камеры DCM900 SCOPE.

Этические аспекты / Ethical aspects

Работа проводилась с соблюдением правил научных исследований и принципов биоэтики. Исследование с использованием животных выполнено в соответствии с приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации № 199н от 1 апреля 2016 г. «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» и ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики».

Статистический анализ / Statistical analysis

Статистический анализ эффектов проводили в программах Excel (Microsoft, США) и Statistica 7.0 (StatSoft Inc., США). Для изученных неврологических параметров выполняли подсчет среднего и стандартного отклонения (M±SD). Данные по объему опухолевых узлов и значимости других межгрупповых различий анализировали с помощью критериев Краскелла–Уолисса и Данна (т.е. p-значения множественного сравнения Краскела–Уоллиса с поправкой Бонферрони – иначе говоря, критерия Краскелла–Уоллиса для оценки статистической достоверности различий медиан трех и более независимых групп с последующим применением теста Данна). Различия полагали достоверными на уровне значимости 0,05. Дозозависимость воздействия LiAsc оценивали посредством линейной аппроксимации соответствующих показателей.

РЕЗУЛЬТАТЫ / RESULTS

Влияние различных дозировок на показатели судорог / Dose-dependent effect on seizure parameters

У всех животных была воспроизведена тиосемикарбазидная модель первично-генерализованных судорог, характерными признаками которых являлись нерегулярные, но частые вздрагивания, спорадический бег по манежу, частые тонико-клонические судороги (табл. 1).

Несмотря на то что карбонат лития достоверно снижал степень выраженности с точки зрения их длительности (р=0,018), это было единственное достоверное наблюдение при сравнении с группой контроля. В то же время LiAsc в дозе 5 мг/кг/сут стимулировал повышение латентного периода (+5 мин; р=0,024) и снижал длительность судорог (–7 мин; р=0,011). При повышении дозы до 10 или 15 мг/кг/сут наблюдались не только значимое увеличение латентного периода до судорог (+5 мин; р=0,03) и снижение длительности приступов (–12 мин; р=0,0011), но и достоверное снижение числа судорожных приступов (–1; р<0,05) и количества животных с признаком «тоническая экстензия» (33%, контроль – 100%; р=0,01) (рис. 1).

Показан дозозависимый эффект LiAsc на встречаемость тонической экстензии в тиосемикарбазидной модели: частота данного признака достоверно отличалась между группами, получавшими LiAsc в дозах 5 и 10 мг/кг/сут: 83% и 33% соответственно (р=0,04) (рис. 2).

Таким образом, использование 10–15 мг/кг/сут LiAsc статистически значимо не только уменьшало длительность судорог (р=0,01), но и увеличивало латентный период до их наступления (р=0,03), снижало число приступов (р<0,05) и частоту встречаемости тонической экстензии (р=0,01). Результаты исследования указывают на то, что доза LiAsc 10 мг/кг/сут является достаточной для снижения неврологического дефицита при воспроизведении модели тиосемикарбазидных судорог. Этот вывод подтверждается данными патогистологического исследования образцов головного мозга.

Патогистологический анализ / Histopathological analysis

Воспроизведение тиосемикарбазидной модели в контрольной группе сопровождалось дисциркуляцией крови (гемостаз, периваскулярный отек, тромбоз) в нервной ткани (рис. 3а, 3b). В условиях нарушения проницаемости сосудистой стенки в 4 случаях контрольной группы наблюдались мелкоочаговые паренхиматозные кровоизлияния в стволе и белом веществе больших полушарий (рис. 3с), а также в 1 случае – очаговое субарахноидальное кровоизлияние (рис. 3d).

При воспроизведении модели установлено ишемически-токсическое повреждение коры головного мозга (особенно в полушарной зоне) с элементами нейродегенерации (набухание и деструкция миелина). Оно характеризовалось набуханием тела и аксона нейронов, исчезновением грануляции по Нисслю, размыванием контуров клеточного ядра (рис. 4а), некрозом и нейрофагией (рис. 4b), пикнозом нейронов и клеток глии (рис. 4c). Для набухания миелиновых волокон была характерна визуально обнаруживаемая неравномерность в распределении слоя миелина, которая сопровождалась своего рода утолщениями по типу «варикоз» (рис. 4d).

Карбонат лития не способствовал существенному снижению дисциркуляции крови: как и в контроле, во всех наблюдениях часто отмечались гемостаз, тромбы, отеки серого и белого вещества на фоне диапедезных кровоизлияний (рис. 5а), набухание нейроцитов, размытие контуров ядра (рис. 5b), пикноз, гипертрофия астроцитов (рис. 5с) и, опять же, крайне выраженные нарушения в распределении миелина (рис. 5d).

В группе, получавшей LiAsc в дозе 5 мг/кг, наблюдался судорожный синдром артериол и снижение степени гемостаза капилляров до диффузно-очаговой. Важно отметить венозное полнокровие, умеренную степень отека серого и белого вещества, умеренное размытие контура ядра и снижение набухания аксонов (рис. 6а). Макроглиальная реакция нервной ткани была минимальной (отек), а нарушения структуры миелина сводились к локальной фрагментации (рис. 6b).

Применение LiAsc в более высоких дозах (10 и 15 мг/кг) способствовало дальнейшему сокращению негативных тенденций, наблюдаемых в контроле и снижавшихся при низкой дозе LiAsc: отдельные нарушения микроциркуляторного русла нервной ткани (рис. 7а), слабый отек, токсические повреждения нейронов отмечены только для отдельных клеток в ткани, поддерживалась целостность клеточного ядра (рис. 7b), наблюдались единичные случаи демиелинизации нервных пучков, которые характеризовались четкими границами (рис. 7c).

Результаты морфометрического анализа количественно подтверждают описанные выше качественные наблюдения (табл. 2). И карбонат лития, и LiAsc в исследованных дозировках вызывают увеличение числа неповрежденных нейронов (на 10–20%). Однако применение карбоната лития не приводит к сколько-нибудь заметному снижению частоты встречаемости необратимых изменений нейронов, а введение LiAsc способствует уменьшению числа наблюдаемых необратимых изменений в среднем на 6,8% и увеличению числа неповрежденных нейронов на 10%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

В экспериментальной фармакологии противосудорожная активность химических соединений наиболее ярко проявляется на моделях генерализованной эпилепсии, создаваемых у животных при введении конвульсантов (стрихнин, тиосемикарбазид, коразол, бикукуллин, бемегрид, пикротоксин и др.).

Тиосемикарбазидная модель судорог содержит элементы, характерные и для ишемического, и для нейродегенеративного повреждения нервной ткани ствола и больших полушарий мозга. Тиосемикарбазид вызывает обратимые приступы путем модуляции ГАМК¹-ергических синаптических процессов, приводящих к сужению синаптической щели, снижению концентрации ГАМК путем блокирования ГАМК-зависимых хлор-ионных каналов (ХИК). На начальном этапе формирования судорожного ответа тиосемикарбазид модулирует патогенетический паттерн токсического судорожного синдрома, инициируя блокирование ГАМК-зависимых ХИК. Патогенез тиосемикарбазид-зависимых приступов помимо влияния на начальном периоде судорог на ГАМК-трансмиссию впоследствии вовлекает и другие нейромедиаторные системы (модулирующие активность холинергической и дофаминергической нейротрансмиссии), в частности обмен лития с модуляцией каналов для Cl и Li.

Результаты представленного исследования показали дозозависимый эффект LiAsc на неврологические показатели судорог в тиосемикарбазидной модели. Данные гистопатологического анализа позволяют утверждать, что нейропротекторное действие LiAsc имеет гистологическое и морфометрическое подтверждение. Карбонат лития не способствовал сохранению структуры нервной ткани при поражении тиосемикарбазидом.

Демиелинизация и другие нарушения структуры нервного волокна были минимальны при нейропротекции LiAsc, в отличие от характерной демиелинизации при использовании карбоната лития (которая, заметим, наблюдалась и в контрольной группе в той же степени выраженности). Можно предположить, что применение карбоната лития в условиях созданной модели первично-генерализованных приступов оказывает слабозаметный нейропротективный эффект, не обеспечивает сохранность миелиновых волокон и не влияет на уровень расстройства кровообращения. По всей видимости, доза LiAsc 10 мг/кг/сут достаточна для снижения неврологического дефицита при воспроизведении модели тиосемикарбазидных судорог.