Микроэлементный состав препаратов этилметилгидроксипиридин сукцината как индикатор качества фармацевтической стандартизации средств для вспомогательной терапии эпилепсии

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

Возникающее при эпилепсии первичное повреждение нейроглии стимулирует дисрегуляцию биосинтеза и секреции ряда нейромедиаторов. Отмечаются развитие глутаматной эксайтотоксичности, ухудшение обмена гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) и гипофункция ГАМКергических нейронов, нарушение работы рецепторных комплексов (ГАМКергического, ацетилхолинового, серотонинергического и др.). Для нормализации нейротрансмиттерного баланса и снижения судорожной готовности применяются антиконвульсанты, участвующие в блокаде натриевых и кальциевых каналов, ингибировании возбуждающих эффектов глутамата, усиливающие ГАМКергическую нейротрансмиссию. Развивающееся воспаление усугубляет деструктивные процессы в центральной нервной системе, что обусловливает необходимость применения дополнительных групп препаратов [1].

Повышение эффективности фармакотерапии эпилепсии сосудистого генеза и снижение побочного действия антиконвульсантов возможно посредством сочетанного применения с препаратами антиоксидантного и антигипоксантного действия. В частности, перспективной группой препаратов для включения в фармакотерапию эпилепсии являются лекарственные средства на основе этилметилгидроксипиридина сукцината (ЭМГПС) [2].

ЭМГПС оказывает антиоксидантный, антигипоксантный, анксиолитический, антистрессовый, противосудорожный, нейропротективный, ноотропный, антиамнестический, кардиопротективный, противосклеротический, антиагрегантный, противопаркинсонический, вегетотропный эффекты [3]. В отличие от ряда других препаратов нейропротекторного действия, для ЭМГПС показано прямое нейропротекторное действие на культуре нейронов в условиях глутаматного стресса (выживаемость клеток повышалась в среднем на 20%) [4]. Эти эффекты ЭМГПС не только важны для терапии ишемических заболеваний головного мозга и торможения нейродегенерации, но и полезны для фармакотерапии эпилепсии сосудистого генеза.

Столь широкий спектр фармакологического действия ЭМГПС обусловлен особыми свойствами молекулы. Фармакология ЭМГПС детально охарактеризована в исследованиях in vitro, in vivo, in silico. Хемопротеомное профилирование молекулы продемонстрировало противовоспалительные (ингибирование арахидонат-5-липоксигеназы, гидролазы лейкотриена A4, рецепторов лейкотриена B4), антигипоксантные, антиоксидантные, нейротрофические, нейропротекторные и вазорелаксирующие эффекты [5], также раскрыв перспективы ЭМГПС как сахароснижающего и гиполипидемического средства [6]. Хемотранскриптомный анализ воздействия молекулы ЭМГПС на нейроциты указал на повышение транскрипции генов, кодирующих белки, участвующие в нейротрансмиссии, осуществление нейропротекторных и нейротрофических эффектов [7]. Геронтоинформационные оценки показали, что ЭМГПС может способствовать увеличению средней продолжительности жизни модельных организмов C. elegans (+23%), мушек-дрозофил (+14%) и мышей (+15%) [8].

Кроме того, подтверждена эффективность использования инъекционных и пероральных форм ЭМГПС в комплексной терапии ишемической болезни сердца, хронической сердечной недостаточности, острого коронарного синдрома и артериальной гипертонии. Установлены положительные результаты применения ЭМГПС в терапии гипоксических поражений мозга у детей, назначения его как ноотропного средства, а также в терапии нейроинфекций и гипоксических нарушений сердечно-сосудистой системы [3].

Следует отметить, что все описанные выше фармакологические эффекты подразумевают использование высокоочищенных субстанций ЭМГПС, которые не содержат тех или иных примесей, способных негативно повлиять на фармакологическую активность препаратов. Следовательно, вопросы очистки и стандартизации субстанций ЭМГПС имеют принципиальное значение для обеспечения эффективности и безопасности препаратов.

Одним из универсальных технологических маркеров чистоты препаратов является их микроэлементный (МЭ) профиль, установление которого представляет собой современную процедуру молекулярной фармакологии и фармацевтики. Важность анализа МЭ-профиля обусловлена несколькими причинами.

Во-первых, эссенциальные (жизненно необходимые) МЭ могут проявлять самостоятельные нейропротекторные и антиконвульсантные эффекты [9]. Например, нетоксичные соли лития с органическими анионами (в т.ч. аскорбат лития) проявляют антиконвульсантные эффекты уже в весьма малых дозах – 5 мг/кг (т.е. 250 мкг/кг элементного лития) [10].

Во-вторых, содержание токсических и условно токсических элементов характеризует степень очистки и качества фармацевтической стандартизации препаратов. Содержание даже малых доз токсических МЭ может оказывать негативное действие при долговременном приеме соответствующего препарата.

В-третьих, анализ МЭ-профиля позволяет не только установить степень очистки препарата, но и сделать обоснованные предположения об используемых для его приготовления веществах, некоторых технологических особенностях производства и т.д. [11].

Цель – анализ профилей МЭ-состава 11 препаратов ЭМГПС, которые перспективно использовать для повышения эффективности и безопасности фармакотерапии эпилепсии.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ / MATERIAL AND METHODS

В работе представлены результаты МЭ-анализа состава препаратов на основе ЭМПГС. Методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой в каждом образце определено содержание 72 элементов периодической таблицы Д.И. Менделеева. Затем проведена серия анализов МЭ-состава препаратов ЭМГПС посредством современных методов интеллектуального анализа данных.

Образцы препаратов / Drug samples

Исследовано 11 препаратов ЭМГПС (табл. 1), для каждого из которых собирали три образца, закупленных в интернет-магазине¹. Заказ делали через сайт онлайн-аптеки (агрегатор) и получали при посещении офлайн-аптеки. В изученных образцах проводили определение полного профиля 72 МЭ (элементов Li, Be, B, Na, Mg, Al, Si, C, P, S, Cl, K, Ca, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Ge, As, Se, Br, Rb, Sr, Y, Zr, Nb, Mo, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, Sn, Sb, Te, I, Cs, Ba, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Hf, Ta, W, Re, Os, Ir, Pt, Au, Hg, Tl, Pb, Bi, Th, U), затем выполняли усреднение и рассчитывали дисперсии содержания каждого элемента.

Определение микроэлементного состава / Determining microelement composition

Элементный анализ образцов выполняли на базе кафедры клинической и лабораторной диагностики ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России с помощью атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой согласно методикам, изложенным в рекомендациях Р.Т. Тогузова и А.Ю. Волкова (2009 г.) [12]. Выбранный метод обеспечивает правильность и хорошую воспроизводимость результатов, достаточный предел обнаружения, избирательность и производительность.

Образцы упаривали при t=105 °C в течение 10–12 ч в сушильном шкафу. После этого проводили взвешивание на аналитических весах PerkinElmer AD-6 Autobalance (PerkinElmer, США) с точностью до 0,1 мг. Навески материала переносили в автоклав (тефлоновый сосуд Весселя) и добавляли 1 мл 70% азотной кислоты высокой чистоты, прошедшей вторичную перегонку. Затем автоклав помещали в микроволновую систему пробоподготовки MD-2000 (CEM, США), обеспечивающую высокие давление и температуру кипения. После охлаждения полученных растворов в течение 60 мин от них отбирали образцы в объеме 1 мл в пластиковые сосуды и разбавляли в 5 раз бидистиллированной и деионизированной водой. В качестве внутреннего стандарта в растворы вводили индий в концентрации 25 мкг/л.

Полученные растворы анализировали на масс-спектрометре с ионизацией в индуктивно-связанной плазме VG Plasmaquad PQ2 Turbo Plus (VG Instruments, Великобритания), с рабочей мощностью генератора сверхвысокочастотного излучения 1,3 кВт, расходом плазмообразующего газа (аргона) 14 л/мин, расходом транспортирующего газа 0,89 мл/мин. Проводили три экспозиции каждого образца, время интегрирования сигнала составило 60 с. Результаты анализа «холостой пробы» автоматически вычитались. Единицы измерения – мкг/кг (ppb).

Данный метод является наиболее точным и производительным, он позволяет точно определять количественное содержание большей части элементов таблицы Д.И. Менделеева с минимальной навеской [12]. В изученных образцах препаратов определено содержание 72 химических элементов.

Кластерный анализ / Cluster analysis

В ходе анализа данных скрининга использованы новые математические подходы для установления кластеров (метрических сгущений) в пространстве параметров МЭ-состава и построения метрических карт [13][14]. Применяли метод, основанный на фундаментальной концепции метрики (в математике метрика – функция измерения расстояния между точками, которая удовлетворяет аксиоме треугольника) [15, 16]. Набор точек с заданной метрикой называется метрической конфигурацией. Измеряя попарные расстояния между этими точками, можно установить метрические сгущения (кластеры близколежащих точек) и затем построить метрические карты (проекции метрических конфигураций на плоскость), которые являются наглядными диаграммами, отражающими весь массив исследованных корреляций.

В качестве «точек» рассматривали исследуемые препараты, и расстояния между ними вычисляли на основании их МЭ-состава. Таким образом получена метрическая карта препаратов. «Микроэлементное расстояние» d_p(i, j) между препаратами i и j вычисляли в соответствии с определением евклидовой метрики для n микроэлементов:

,

где m_ki – содержание k-го МЭ в i-м препарате; m_kj – содержание k-го МЭ в j-м препарате, F_k: R⁺ → [ 0,…,1] – эмпирическая функция распределения измеренных значений k-го МЭ.

Также определяли расстояния между парами МЭ с получением метрической карты МЭ. Расстояние d_МЭ(i, j) определяли как коэффициент корреляции между содержанием МЭ в исследованных препаратах.

Для поиска метрических сгущений (кластеров) на полученных метрических конфигурациях принимается, что над некоторым множеством X = {x_i,…,x_N}, состоящим из N точек, задана метрика ρ_ij = ρ(x_i, x_j), определенная на всех парах точек из X. Метрическим сгущением называется множество близких (в смысле заданной метрики) точек, образующих компактные области. Полученные в работах [15][16] теоретические результаты позволили определить семейство новейших алгоритмов поиска сгущений (или так называемых алгоритмов кластеризации), которые основаны на «восстановлении» множества по компонентам его проекции на оси метрической конфигурации. Параметрами произвольного алгоритма из этой группы являются способ вычисления значений метрики ρ_ij и распределение σ. Алгоритмы могут отличаться друг от друга используемым определением обобщенной плотности η, способом построения непрерывных представлений i-спектров {γ^σ(r)} (осуществляемым с точностью до σ), способом выбора окрестности точки при анализе сгущений, способом выбора границ сгущений (или, наоборот, разрежений), критериями оценки качества набора сгущений и другими параметрами. Метрическая карта представляет собой проекцию метрической конфигурации на плоскость на основе расстояний точек ρ-сети от остальных точек метрической конфигурации.

Статистический анализ / Statistical analysis

Для стандартной обработки результатов исследования использовали методы математической статистики, включающие расчет числовых характеристик случайных величин, проверку статистических гипотез с применением параметрических и непараметрических критериев, корреляционного и дисперсионного анализа. Сравнение проводили с помощью критерия χ², T-критерия Вилкоксона–Манна–Уитни и теста Стьюдента. Использовали прикладную программу Statistica 6.0 (StatSoft, США) и электронные таблицы Microsoft Excel (Microsoft, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ / RESULTS

Перед тем как перейти к анализу особенностей МЭ-состава каждого из исследованных препаратов, рассмотрим более общую картину, полученную посредством кластерного анализа данных.

Метрические карты / Metric maps

Анализ метрической карты МЭ (рис. 1) показал наличие трех кластеров микроэлементов, содержание которых коррелировало в исследованных препаратах: кластер редкоземельных элементов-лантаноидов (La, Ce, Nd, Sm, Eu, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu), кластер «ниобий – вольфрам – цирконий» (Nb-W-Zr), кластер «натрий – алюминий – бор» (Na-Al-B). Наличие этих кластеров позволяет анализировать корреляции между содержанием различных МЭ в исследованных препаратах ЭМГПС (см. далее).

Полученные профили МЭ-состава позволили построить соответствующую метрическую карту, отражающую степень близости МЭ-состава исследованных препаратов (рис. 2). Ее анализ методами поиска метрических сгущений указал на наличие единственного кластера, включающего ампульные формы препарата ТМ-1, препарата ТМ-5, а также препаратов ТМ-9 различных производителей. Это дает возможность сделать весьма важный вывод: МЭ-составы (а следовательно, и степень очистки, и определенные стадии производства) существенно отличаются у большинства препаратов ЭМГПС.

Содержание токсичных элементов / Content of toxic elements

Полученные данные позволили провести анализ содержания токсичных и условно токсичных элементов в составе препарата (табл. 2) в сравнении с установленными в Российской Федерации уровнями предельно допустимых концентраций (ПДК)² по каждому элементу.

Важно разобрать, каким образом следует интерпретировать превышение значения ПДК. Показатели ПДК, приводимые в СанПиН, подразумевают, что человек выпивает в день 1–2 л воды и при этом превышение ПДК, носящее хронический характер, действительно может стимулировать отравление соответствующими токсическими элементами. В то же время при использовании перечисленных препаратов 1 л раствора из ампулы будет употребляться за гораздо более длительный срок – не менее 3–4 нед. Поэтому превышение ПДК вовсе не подразумевает сколько-нибудь значимого токсического эффекта. Тем не менее уровни токсических элементов в составе препаратов позволяют сделать определенные выводы о технологии их производства.

Содержание натрия и хлора / Content of sodium and chlorine

Важными показателями элементного состава является содержание натрия и хлора в исследованных препаратах и их соотношение (табл. 3). Во-первых, следует отметить, что концентрации этих двух МЭ существенно отличаются (на 2–3 порядка) для различных препаратов. Во-вторых, их соотношение также значительно варьируется, т.е. уровни содержания этих МЭ по большей части не зависят друг от друга.

Высокая вариабельность и независимость показателей содержания натрия и хлора друг от друга указывают на возможные отличия в технологии производства препаратов. Известно, что для стандартизации рН используются растворы щелочей (при избыточной кислотности стандартизируемого раствора) или растворы кислот (при избыточной щелочной реакции стандартизируемого раствора). В качестве щелочи наиболее часто применяются растворы гидроксида натрия, а в качестве кислоты – растворы соляной кислоты.

Таким образом, можно сделать вывод, что при производстве исследованных образцов ампульных форм препаратов ТМ-3, ТМ-4, ТМ-5, ТМ-6 получаемые растворы отличаются избыточной кислотностью, что означает необходимость нейтрализации посредством растворов гидроксида натрия. В то же время при производстве ампульных форм препаратов ТМ-8, ТМ-9 (П-3) получаемая среда отличается избыточной щелочной реакцией, что обусловливает использование соляной кислоты. В случае препартов ТМ-3 и ТМ-8, для которых были найдены высокие значения и натрия, и хлора, можно предположить использование многочисленных последовательных циклов нейтрализации то кислотой, то щелочью. У остальных препаратов (ТМ-1, ТМ-2, ТМ-7, ТМ-9 (П-1), ТМ-9 (П-2)) содержание и натрия, и хлора было достаточно низким, что указывает на минимальное использование растворов гидроксида натрия или соляной кислоты для нормализации рН.

Особенности микроэлементного состава препаратов / Features of drug microelement composition

Совместный анализ результатов определения МЭ (токсических, натрия, хлора и др.), кластеризации препаратов по МЭ-составу (см. рис. 1) и корреляций между МЭ (см. рис. 2) позволяет сделать дополнительные выводы о взаимосвязи МЭ-состава со степенью чистоты препарата.

Особенности МЭ-состава исследованных препаратов (табл. 4) показывают, что из препаратов кластера ТМ-9 (см. рис. 2) наибольшей степенью очистки отличается ТМ-9 (П-3): он содержит достоверно повышенные уровни только хлора и европия – практически нетоксичных МЭ. В то же время, например, ТМ-5 характеризуется повышенными относительно среднего значения по выборке уровнями Cd, Bi, а препарат ТМ-1 – несколько повышенным уровнем Pb.

Остальные препараты также имеют уникальный МЭ-состав. Например, ТМ-3 и ТМ-7 отличаются повышенным содержанием многочисленных МЭ из «редкоземельного кластера» (см. рис. 1). ТМ-3, кроме того, характеризуется повышенными уровнями ртути и элементов кластера Nb-W-Zr (см. рис. 1). Такого рода кластерные корреляции между содержанием многих МЭ (в частности, редкоземельных элементов) указывает на используемую при производстве воду как возможный источник этих МЭ.

Препараты ТМ-4, ТМ-6 и, отчасти, ТМ-8 характеризуются повышенным содержанием элементов из кластера Na-Al-B (см. рис. 1). Данные примеси могут являться результатом использования щелочи (гидроксида натрия) того или иного производителя на стадии регулировки рН препаратов.

И наконец, следует отметить еще одно очень важное наблюдение: препараты с повышенным содержанием натрия (ТМ-3, ТМ-4, ТМ-5, ТМ-6, ТМ-8) отличаются также повышенным уровнем МЭ-примесей: от 5 (ТМ-5, ТМ-8) до 20 (ТМ-3). В то же время препарат с повышенным уровнем хлора, но не натрия (ТМ-9 (П-3)) имеет лишь две дополнительные примеси – повышенные уровни низкотоксичных хлора и европия.

Таким образом, степень МЭ-чистоты препарата ЭМГПС может быть существенно повышена, если в процессе его синтеза поддерживается слабощелочная среда, а «доводка» рН до нейтральных значений осуществляется посредством растворов высокоочищенной соляной кислоты. Действительно, степень очистки соляной кислоты от примесей может повышаться практически неограниченно посредством многократной ректификации (перегонки) ее раствора (которая с легкостью может быть осуществлена в любой заводской лаборатории). В свою очередь, получение высокочистых растворов гидроксида натрия требует применения крайне дорогостоящего оборудования для разделения химических элементов и практически не реализуемо в условиях реального фармацевтического производства. Альтернативно возможно использование сверхчистых растворов гидроксида натрия, что может несколько повысить стоимость производства.

ОБСУЖДЕНИЕ / DISCUSSION

Клинические исследования показали, что использование ЭМГПС в комплексной реабилитации пожилых пациентов, перенесших острую церебральную недостаточность, способствует улучшению когнитивных функций, снижению тревожности и депрессии, а также повышению мышечной силы и мобильности [17].

Экспериментальные тесты на старых крысах-самцах линии Вистар продемонстрировали, что длительное применение ЭМГПС увеличивает продолжительность жизни, улучшает обучение, повышает судорожный порог, мышечный тонус и координацию движений, нарушенные при старении [18].

ЭМГПС, обладающий антиоксидантными и нейропротективными свойствами, применяется в комплексной терапии эпилепсии для повышения эффективности лечения и снижения побочных эффектов противосудорожных препаратов. Исследования показывают, что добавление ЭМГПС к стандартной терапии карбамазепином усиливает противосудорожное действие и позволяет снизить дозы последнего, что подтверждается уменьшением эпилептиформной активности в экспериментальных моделях [19].

Кроме того, клинические наблюдения свидетельствуют о положительном влиянии ЭМГПС и карбамазепина на течение фармакорезистентной парциальной эпилепсии, снижая частоту эпилептических пароксизмов и улучшая показатели электроэнцефалографии [20].

Профиль содержания МЭ является одним из универсальных технологических маркеров степени очистки и стандартизации фармацевтических препаратов, позволяющим проводить сравнительные анализы степени очистки препаратов [11][21][23]. Данный подход к оценке степени чистоты и стандартизации лекарственных средств практически незаменим в случае препаратов на основе природного сырья [24–26]. Анализ МЭ-профиля позволяет также устанавливать новые, неожиданные свойства препаратов [24][27][28].

Комплексных исследований МЭ-состава препаратов ЭМГПС ранее не проводилось. В нашей работе впервые получены уникальные результаты, позволяющие не только обоснованно предположить отдельные технические детали производства конкретных образцов ЭМГПС, но и указать на наиболее вероятные подходы к существенному улучшению качества МЭ-очистки при их изготовлении. Также выявлены препараты, отличающиеся наилучшей степенью очистки, что указывает на достаточно современные условия их производства.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

Проведен анализ МЭ-состава 11 препаратов ЭМГПС. Методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой в каждом образце определено содержание 72 элементов периодической таблицы Д.И. Менделеева. МЭ-профили ЭМГПС различаются, причем даже препараты одной торговой марки и одной формы выпуска (раствор для инъекций) могут содержать разный МЭ-состав, в т.ч. токсичные и условно токсичные МЭ в количествах, близких или превышающих ПДК.

МЭ-примеси в составе препаратов могут поступать из воды, гидроксида натрия и соляной кислоты, используемых при производстве. Предполагается, что МЭ-качество препарата может быть существенно повышено, если для нормализации рН используются растворы соляной кислоты, очищенные в результате проведения последовательной ректификации.

С возрастом снижаются выводящие функции печени и почек, замедляется метаболизм лекарств, быстрее накапливаются токсичные МЭ, поэтому препараты на основе ЭМГПС широко применяются в геронтологии благодаря не только своим нейропротективным и антиоксидантным свойствам, но и очень низкой токсичности. При эпилепсии ЭМГПС могут назначаться по показаниям в составе комплексной терапии вместе с антиконвульсантами. Анализ профилей МЭ-состава образцов ЭМГПС указал на препараты, которые перспективно использовать для повышения эффективности и безопасности фармакотерапии эпилепсии сосудистого генеза посредством торможения глутаматной эксайтотоксичности, антиоксидантного и антигипоксантного действия.